Количественная оценка вируса

Определить концентрацию вируса

Квантификация вируса — это подсчет или вычисление количества вирусных частиц (вирионов) в образце для определения концентрации вируса. Она используется как в научно-исследовательских и опытно-конструкторских работах (НИОКР) в академических и коммерческих лабораториях, так и в производственных ситуациях, где количество вируса на различных этапах является важной переменной, которую необходимо контролировать. Например, производство вакцин на основе вирусов , рекомбинантных белков с использованием вирусных векторов и вирусных антигенов — все это требует количественной оценки вируса для постоянного мониторинга и/или изменения процесса с целью оптимизации качества продукта и производительности, а также для реагирования на постоянно меняющиеся требования и приложения. Другие примеры конкретных случаев, когда вирусы необходимо количественно оценить, включают скрининг клонов , оптимизацию множественности заражения (MOI) и адаптацию методов к клеточной культуре .

Существует много способов категоризации методов количественной оценки вирусов. Здесь методы сгруппированы в соответствии с тем, что измеряется и в каком биологическом контексте. Например, клеточные анализы обычно измеряют инфекционные единицы (активный вирус). Другие методы могут измерять концентрацию вирусных белков, ДНК, РНК или молекулярных частиц, но не обязательно измерять инфекционность. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, которые часто определяют, какой метод используется для конкретных приложений. ^[1]

Анализы на основе клеток

Анализ бляшек

Вирусные бляшки вируса простого герпеса

Анализы на основе бляшек являются широко используемым методом определения концентрации вируса с точки зрения инфекционной дозы . Анализы на бляшки определяют количество единиц формирования бляшек (БОЕ) в образце вируса, что является одной из мер количества вируса. Этот анализ основан на микробиологическом методе, проводимом в чашках Петри или многолуночных планшетах для культивирования клеток . В частности, сливающийся монослой клеток- хозяев инфицируется путем нанесения образца, содержащего вирус в различных разведениях, а затем покрывается полутвердой средой , такой как агар или карбоксиметилцеллюлоза , для предотвращения беспорядочного распространения вирусной инфекции, как это произошло бы в жидкой среде. Вирусная бляшка образуется после того, как вирус заражает клетку в фиксированном клеточном монослое. ^[2] Инфицированная вирусом клетка лизируется и распространяет инфекцию на соседние клетки, где цикл от заражения до лизиса повторяется. Это создает область инфицированных, лизированных клеток (вирусная бляшка), окруженную неинфицированными, неповрежденными клетками. Бляшку можно увидеть с помощью оптического микроскопа или визуально, используя методы окрашивания клеток (например, окрашивание раствором кристаллического фиолетового для визуализации неповрежденных и лизированных клеток). ^[3] Образование бляшек может занять 3–14 дней, в зависимости от анализируемого вируса. Бляшки обычно подсчитываются вручную, а количество бляшек в сочетании с коэффициентом разбавления инфекционного раствора (образца, изначально нанесенного на клетки) используется для расчета количества единиц, образующих бляшки, на единицу объема образца (БОЕ/мл). Число БОЕ/мл представляет собой концентрацию инфекционных вирусных частиц в образце и основано на предположении, что каждая образованная бляшка является репрезентативной для первоначального заражения одной инфекционной вирусной частицей. ^{[4] [5]}

Анализ формирования фокуса (FFA)

Клетки, инфицированные ротавирусом (вверху) и неинфицированные клетки (внизу)

Анализ формирования фокуса (FFA) является разновидностью анализа бляшек, но вместо того, чтобы зависеть от лизиса клеток для обнаружения образования бляшек, FFA использует методы иммуноокрашивания с использованием флуоресцентно меченых антител, специфичных для вирусного антигена , для обнаружения инфицированных клеток хозяина и инфекционных вирусных частиц до образования фактической бляшки. FFA особенно полезен для количественной оценки классов вирусов, которые не лизируют клеточные мембраны, поскольку эти вирусы не поддаются анализу бляшек. Как и в анализе бляшек, монослои клеток хозяина заражаются различными разведениями образца вируса и инкубируются в течение относительно короткого инкубационного периода (например, 24–72 часа) под полутвердой покровной средой, которая ограничивает распространение инфекционного вируса, создавая локализованные кластеры (очаги) инфицированных клеток. Затем пластины зондируются флуоресцентно мечеными антителами против вирусного антигена, а для подсчета и количественной оценки количества очагов используется флуоресцентная микроскопия . Метод FFA обычно дает результаты за меньшее время, чем анализы бляшек или анализы пятидесятипроцентной инфекционной дозы культуры ткани (TCID ₅₀ ) (см. ниже), но он может быть более дорогим с точки зрения требуемых реагентов и оборудования. Время завершения анализа также зависит от размера области, которую подсчитывает пользователь. Большая область потребует больше времени, но может обеспечить более точное представление образца. Результаты FFA выражаются в единицах формирования фокуса на миллилитр, или FFU/мл. ^[6]

TCID50анализ конечной точки разбавления

Анализ TCID ₅₀ (50% Tissue Culture Infectious Dose) является мерой титра инфекционного вируса . Этот анализ разбавления конечной точки количественно определяет количество вируса, необходимое для уничтожения 50% инфицированных хозяев или для создания цитопатического эффекта в 50% инокулированных клеток культуры ткани. Этот анализ может быть более распространен в клинических исследовательских приложениях, где необходимо определить летальную дозу вируса или если вирус не образует бляшек. ^{[ необходима цитата ]} При использовании в контексте культуры ткани клетки-хозяева высеваются и добавляются серийные разбавления вируса. После инкубации вручную наблюдается и регистрируется процент гибели клеток (т. е. инфицированных клеток) для каждого разбавления вируса, а результаты используются для математического расчета результата TCID _50. ^{[6] [7]} Из-за явных различий в методах и принципах анализа результаты TCID ₅₀ и БОЕ/мл или других анализов инфекционности не эквивалентны. Этот метод может занять до недели из-за времени инфекционности клеток. ^[8]

Для расчета TCID ₅₀ обычно используются два метода (которые также могут использоваться для расчета других типов 50% конечной точки, таких как EC50 , IC50 и LD50 ):

• Спирмен–Кербер ^[9]
• Метод Рида–Мюнха

Теоретическое соотношение между TCID ₅₀ и PFU составляет приблизительно 0,69 PFU = 1 TCID ₅₀ на основе распределения Пуассона ^[10] , вероятностного распределения , которое описывает, сколько случайных событий (вирусных частиц), происходящих с известной средней скоростью (титр вируса), вероятно, произойдет в фиксированном пространстве (количество вирусной среды в лунке). Однако следует подчеркнуть, что на практике это соотношение может не соблюдаться даже для одной и той же комбинации вирус + клетка, поскольку два типа анализа настроены по-разному, а инфекционность вируса очень чувствительна к различным факторам, таким как возраст клеток, накладываемая среда и т. д. Но следующая ссылка определяет это соотношение по-другому:

Из ATTC : «Предполагая, что используется та же самая система клеток, что вирус образует бляшки на этих клетках и что не добавляются процедуры, которые бы ингибировали образование бляшек, можно ожидать, что 1 мл вирусного раствора будет содержать около половины числа бляшкообразующих единиц (БОЕ) в качестве TCID ₅₀ . Это всего лишь оценка, но она основана на том обосновании, что предельное разведение, которое заразит 50% затронутых клеточных слоев, как часто ожидается, изначально приведет к образованию одной бляшки в клеточных слоях, которые будут инфицированы. В некоторых случаях могут случайно образоваться две или более бляшек, и, таким образом, фактическое число БОЕ должно быть определено экспериментально.

«Математически ожидаемые PFU будут несколько больше половины TCID ₅₀ , поскольку отрицательные пробирки в TCID ₅₀ представляют собой ноль бляшкообразующих единиц, а положительные пробирки представляют собой одну или несколько бляшкообразующих единиц. Более точная оценка получается путем применения распределения Пуассона. Где ⁠ ⁠ ${\displaystyle P(o)}$ — доля отрицательных пробирок, а m — среднее число инфекционных единиц на объем (PFU/мл), ⁠ ⁠ ${\displaystyle P(o)=\exp(-m)}$ . Для любого титра, выраженного как TCID ₅₀ , ⁠ ⁠ ${\displaystyle P(o)=0.5}$ . Таким образом ⁠ ⁠ ${\displaystyle \exp(-m)=0.5}$ и ⁠ ⁠ , ${\displaystyle m=-\ln 0.5}$ что составляет ~ 0,7.

«Следовательно, можно умножить титр TCID ₅₀ (на мл) на 0,7, чтобы предсказать среднее число БОЕ/мл. При фактическом применении таких расчетов следует помнить, что рассчитанное среднее значение будет действительным только в том случае, если изменения в протоколе, необходимые для визуализации бляшек, не изменят экспрессию инфекционного вируса по сравнению с экспрессией в условиях, используемых для TCID ₅₀ .

«Таким образом, в качестве рабочей оценки можно предположить, что материал с TCID ₅₀ 1 × 10 ⁵ TCID ₅₀ /мл будет производить 0,7 × 10 ⁵ БОЕ/мл». ^[11]

Анализы на основе белков и антител

Существует несколько вариаций количественного анализа вирусов на основе белков и антител. В целом, эти методы количественно определяют либо количество всего белка, либо количество определенного вирусного белка в образце, а не количество инфицированных клеток или вирусных частиц. Количественная оценка обычно основана на колориметрическом или флуоресцентном обнаружении. Некоторые вариации анализа количественно определяют белки непосредственно в образце, в то время как другие вариации требуют инфицирования клетки-хозяина и инкубации, чтобы обеспечить рост вируса перед количественной оценкой. Используемая вариация зависит в первую очередь от количества белка (т. е. вирусного белка) в исходном образце и чувствительности самого анализа. Если требуются инкубация и рост вируса, перед анализом часто проводят лизис/переваривание клеток и/или вируса. Большинство методов на основе белков относительно быстры и чувствительны ^{[ требуется ссылка ],} но требуют стандартов качества для точной калибровки и количественно определяют белок, а не фактическую концентрацию вирусных частиц. Ниже приведены конкретные примеры широко используемых анализов на основе белков.

Реакция гемагглютинации

Анализ гемагглютинации (HA) является распространенным нефлуоресцентным анализом количественного определения белка, специфичным для гриппа . Он основан на том факте, что гемагглютинин , поверхностный белок вирусов гриппа, агглютинирует эритроциты (т. е. заставляет эритроциты слипаться). В этом анализе разведения образца гриппа инкубируются с 1% раствором эритроцитов в течение одного часа, и визуально определяется разведение вируса, при котором впервые происходит агглютинация. Анализ дает результат в единицах гемагглютинации (HAU) с типичными соотношениями PFU к HAU в диапазоне 10 ^{6. [12] [13] [14]} Для завершения этого анализа требуется ~1–2 часа.

Анализ ингибирования гемагглютинации является распространенной вариацией анализа HA, используемой для измерения уровня специфических антител к гриппу в сыворотке крови. В этом варианте сывороточные антитела к вирусу гриппа будут мешать прикреплению вируса к эритроцитам. Таким образом, гемагглютинация ингибируется, когда антитела присутствуют в достаточной концентрации. ^[15]

Анализ бицинхониновой кислоты (БХК)

Анализ бицинхониновой кислоты (BCA; также известный как анализ Смита) основан на простом колориметрическом измерении и является широко используемым анализом количественной оценки белка. ^[16] BCA похож на анализы белка Лоури или Брэдфорда . Реагент для анализа BCA был впервые разработан и произведен в коммерческих целях компанией Pierce Chemical Company (теперь принадлежащей Thermo Fisher Scientific ), которая владела патентом до 2006 года. ^{[17] [18]}

В анализе BCA пептидные связи белка количественно восстанавливают Cu ²⁺ до Cu ¹⁺ , что дает светло-голубой цвет. BCA хелатирует Cu ¹⁺ в соотношении 2:1, что приводит к более интенсивно окрашенному виду, который поглощает при 562 нм. Поглощение образца при 562 нм используется для определения концентрации основного белка в образце. Результаты анализа сравниваются с известными стандартными кривыми после анализа с помощью спектрофотометра или планшетного ридера . ^[19] Общее время анализа составляет от 30 минут до одного часа. Хотя этот анализ является повсеместным и быстрым, ему не хватает специфичности к вирусным белкам, поскольку он подсчитывает все белки в образце. Таким образом, вирусный препарат для количественной оценки должен содержать очень низкие уровни белков клетки-хозяина.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Диаграмма ИФА

Иммуноферментный анализ ( ELISA ) — это анализ на основе антител , который использует антиген -специфическое антитело, химически связанное с ферментом (или связанное со вторым антителом, связанным с ферментом), для обнаружения присутствия неизвестного количества антигена (например, вирусного белка) в образце. Событие связывания антитела с антигеном обнаруживается и/или количественно определяется посредством способности фермента преобразовывать субстратный реагент для получения обнаруживаемого сигнала, который затем может быть использован для расчета концентрации целевого антигена в образце. ^[20] Пероксидаза хрена (HRP) — это распространенный фермент, используемый в схемах ELISA из-за его способности усиливать сигнал и повышать чувствительность анализа.

Существует множество вариаций или типов анализов ELISA, но их можно классифицировать как непрямые , конкурентные , сэндвич-анализы или обратные . ^[21]

Анализ одинарной радиальной иммунодиффузии (SRID)

Анализ одинарной радиальной иммунодиффузии (SRID), также известный как метод Манчини, представляет собой белковый анализ, который определяет количество специфического вирусного антигена путем иммунодиффузии в полутвердой среде (например, агаре). Среда содержит антисыворотку, специфичную для интересующего антигена, а антиген помещается в центр диска. По мере того, как антиген диффундирует в среду, он создает преципитационное кольцо, которое растет до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. Время анализа может варьироваться от 10 часов до дней в зависимости от времени уравновешивания антигена и антитела. Диаметр зоны от кольца линейно связан с логарифмом концентрации белка и сравнивается с диаметрами зон для известных стандартов белка для количественной оценки. ^[22]

ДНК и РНК анализы

Количественная полимеразная цепная реакция (КПЦР)

Количественная ПЦР использует химию полимеразной цепной реакции для амплификации вирусной ДНК или РНК для получения достаточно высоких концентраций для обнаружения и количественной оценки с помощью флуоресценции. В целом, количественная оценка с помощью qPCR основана на серийных разведениях стандартов известной концентрации, которые анализируются параллельно с неизвестными образцами для калибровки и сравнения. Количественное обнаружение может быть достигнуто с использованием широкого спектра стратегий обнаружения флуоресценции, включая зонды, специфичные для последовательности , или неспецифические флуоресцентные красители, такие как SYBR Green . ^[23] Зонды, специфичные для последовательности, такие как TaqMan Molecular Beacons или Scorpion, связываются только с ДНК соответствующей последовательности, полученной во время реакции. Краситель SYBR Green связывается со всей двухцепочечной ДНК ^[24], полученной во время реакции.

Хотя SYBR Green прост в использовании, его недостаточная специфичность и низкая чувствительность приводят к тому, что большинство лабораторий используют схемы обнаружения ПЦР на основе зондов. ^{[ необходима ссылка ]} Существует множество вариаций ПЦР, включая метод сравнительного порога, который позволяет проводить относительную количественную оценку путем сравнения значений Ct (циклов ПЦР, которые показывают статистически значимое увеличение продукта) из нескольких образцов, которые включают внутренний стандарт. ^[25]

ПЦР амплифицирует все целевые нуклеиновые кислоты , включая те, которые происходят из неповрежденных инфекционных вирусных частиц, из дефектных вирусных частиц, а также свободную нуклеиновую кислоту в растворе. Из-за этого результаты qPCR (выраженные в виде копий генома/мл), вероятно, будут выше по количеству, чем результаты TEM. Для количественной оценки вирусов соотношение целых вирионов к копиям нуклеиновой кислоты редко составляет один к одному. Это связано с тем, что во время репликации вируса нуклеиновая кислота и вирусные белки не всегда производятся в соотношении 1:1, а процесс сборки вируса приводит к получению полных вирионов, а также пустых капсидов и/или избыточных свободных вирусных геномов. В примере с вирусом ящура соотношение целых вирионов к копиям РНК в активно реплицирующейся клетке-хозяине составляет приблизительно 1:1000. ^[26] Преимущества титрования методом ПЦР включают быстрое время выполнения (1–4 часа) и чувствительность (может обнаружить гораздо более низкую концентрацию вирусов, чем другие методы).

Анализ частиц

Настраиваемое резистивное импульсное зондирование (TRPS)

Настраиваемое резистивное импульсное зондирование (TRPS) — это метод, который позволяет проводить высокопроизводительные измерения отдельных вирусных частиц, поскольку они по одной проходят через нанопору с регулируемым размером. ^[27] Преимущество этого метода заключается в одновременном определении размера и концентрации вирусных частиц в растворе с высоким разрешением. Это можно использовать для оценки стабильности образца и вклада агрегатов, а также общей концентрации вирусных частиц (vp/мл). ^[28]

Измерение на основе TRPS происходит в ионном буфере, и не требуется предварительного окрашивания образцов перед анализом, поэтому этот метод более быстрый, чем те, которые требуют предварительной обработки флуоресцентными красителями, при этом общее время подготовки и измерения составляет менее 10 минут на образец. ^{[ необходима ссылка ]} Анализ вирусов на основе TRPS доступен в продаже через системы qViro-X , которые можно дезактивировать химическим способом путем автоклавирования после проведения измерения.

Масс-спектроскопия с индуктивно связанной плазмой для одиночных вирусов (SV ICP-MS)

Эта техника похожа на масс-спектроскопию с индуктивно связанной плазмой отдельных частиц (SP ICP-MS ), открытую Дегельдром и Фаваржем (2003) ^[29] и адаптированную позднее для других наночастиц (например, золотых коллоидов, см. Дегельдр и др. (2006)). ^[30] Метод SP ICP-MS был адаптирован для анализа масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой отдельных вирусов (SV ICPMS) в комплексном исследовании, проведенном Дегельдром (2021). ^[31] Это исследование предлагает адаптировать этот метод для идентификации и подсчета отдельных вирусов (SV). Благодаря записям ICP-MS с высоким разрешением и многоканальным секторным полем (MC SF) в режиме обнаружения SV подсчет основных и ключевых ионов может позволить анализ и идентификацию отдельных вирусов. Подсчет 2–500 вириальных единиц может быть выполнен за 20 с. Анализы предлагается проводить в горелке Ar для основных ионов : 12C+, 13C+, 14N+, 15N+ и ключевых ионов 31P+, 32S+, 33S+ и 34S+. Все помехи подробно обсуждаются. Рекомендуется использовать MC ICP-MS высокого разрешения, в то время как варианты с анаэробной/аэробной атмосферой изучаются для улучшения анализа при использовании квадрупольной ICP-MS. Применение для двух типов вирусов (SARS-COV2 и бактериофаг T5) исследуется с использованием временного сканирования и анализа фиксированной массы для выбранных ионов вируса, что позволяет характеризовать виды с использованием молярных соотношений N/C, P/C и S/C и количественной оценки их численной концентрации.

Другие анализы

Проточная цитометрия

Хотя большинство проточных цитометров не обладают достаточной чувствительностью, ^{[ требуется ссылка ]} есть несколько коммерчески доступных проточных цитометров, которые можно использовать для количественной оценки вирусов. Счетчик вирусов определяет количество неповрежденных вирусных частиц в образце с помощью флуоресценции для обнаружения колокализованных белков и нуклеиновых кислот. Образцы окрашиваются двумя красителями, одним специфичным для белков и одним специфичным для нуклеиновых кислот, и анализируются по мере их прохождения через лазерный луч. Количество частиц, производящих одновременные события на каждом из двух отдельных каналов флуоресценции, определяется вместе с измеренной скоростью потока образца для расчета концентрации вирусных частиц (vp/мл). ^[32] Результаты, как правило, аналогичны по абсолютному количеству результату ТЭМ. Анализ имеет линейный рабочий диапазон 10 ⁵ –10 ⁹ vp/мл и время анализа ~10 мин с коротким временем подготовки образца. ^{[ требуется ссылка ]}

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

TEM — это специализированный тип микроскопии, который использует пучок электронов, сфокусированных магнитным полем для получения изображения образца. TEM обеспечивает получение изображений с пространственным разрешением в 1000 раз большим, чем у светового микроскопа (разрешение до 0,2 нм). ^[33] Требуется ультратонкий, негативно окрашенный образец. Подготовка образцов включает в себя нанесение образцов на покрытую сетку TEM и негативное окрашивание электронно-непрозрачной жидкостью. ^[34] Образцы тканей, залитые в ткань, также можно исследовать, если они тонко нарезаны. Подготовка образцов различается в зависимости от протокола и пользователя, но обычно для завершения требуются часы. Изображения TEM могут отображать отдельные вирусные частицы, а количественный анализ изображений может использоваться для определения концентрации вируса. Эти изображения с высоким разрешением также предоставляют информацию о морфологии частиц, которую не могут предоставить большинство других методов. Количественные результаты TEM часто будут выше, чем результаты других анализов ^{[ необходима ссылка ],} поскольку все частицы, независимо от инфекционности, количественно определяются в сообщаемом результате вирусоподобных частиц на мл (vlp/mL). Количественный ТЭМ обычно хорошо работает для концентраций вирусов более 106 ^частиц /мл. Из-за высокой стоимости прибора и необходимого количества пространства и вспомогательных средств оборудование для ТЭМ доступно только в нескольких лабораториях.

Смотрите также

• Список субвирусных агентов
• Минимальная инфицирующая доза
• Вирусная нагрузка

Ссылки

1. Науки, Благородная жизнь. "Методы количественной оценки вирусов". content.noblelifesci.com . Получено 2023-08-07 .
2. Кауфманн, С. Х.; Кабелитц, Д. (2002). Методы в микробиологии, том 32: Иммунология инфекции . Academic Press . ISBN 0-12-521532-0.
3. Baer, ​​Alan; Kehn-Hall, Kylene (4 ноября 2014 г.). «Определение концентрации вируса с помощью анализа бляшек: использование традиционных и новых систем наложения». Журнал визуализированных экспериментов (93): e52065. doi : 10.3791/52065. PMC 4255882. PMID  25407402 . 
4. Мартин, С. Дж. (1978). Биохимия вирусов . Издательство Кембриджского университета . ISBN 0-12-402033-X.
5. Якимович, Артур; Андриасян, Вардан; Витте, Роберт; Ван, И.-Хсуан; Прасад, Вибху; Суомалайнен, Маарит; Гребер, Урс Ф. (28.09.2015). «Plaque2.0 — высокопроизводительная аналитическая структура для оценки передачи вируса от клетки и клонального расширения клеток». PLOS ONE . 10 (9): e0138760. Bibcode : 2015PLoSO..1038760Y. doi : 10.1371/journal.pone.0138760 . ISSN  1932-6203. PMC 4587671. PMID 26413745  . 
6. Flint, SJ; Enquist, W.; Racaniello, VR; Skalka, AM (2009). "Вирусологические методы". Принципы вирусологии . ASM Press. ISBN 978-1-55581-443-4.
7. Линденбах, Бретт Д. «Калькулятор Рида и Мюнха».
8. "Архивная копия" (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 2011-09-27 . Получено 2010-02-26 .{{cite web}}: CS1 maint: архивная копия как заголовок ( ссылка )
9. Кербер, Г. (1931). «Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche». Архив Наунина-Шмидеберга для экспериментальной патологии и фармакологии . 162 (4). Спрингер-Верлаг: 480–483. дои : 10.1007/BF01863914. S2CID  46017573.
10. thneedle (16 апреля 2002 г.). "TCID50 и бляшкообразующая единица (PFU)" . Получено 29 мая 2014 г.
11. "Руководство по вирусологическим культурам". www.atcc.org . Получено 09.08.2023 .
12. Киллиан, МЛ (2008). «Анализ гемагглютинации для вируса птичьего гриппа». В Спэкман, Эрика (ред.). Вирус птичьего гриппа . Т. 436. Humana Press. стр. 47–52. doi :10.1007/978-1-59745-279-3_7. ISBN 978-1-58829-939-0. PMID  18370040.
13. Риммельцваан, GF; Баарс, M.; Клаас, ECJ; Остерхаус, ADME (1998). «Сравнение гибридизации РНК, анализа гемагглютинации, титрования инфекционного вируса и иммунофлуоресценции как методов мониторинга репликации вируса гриппа in vitro ». Журнал вирусологических методов . 74 (1): 57–66. doi :10.1016/S0166-0934(98)00071-8. PMID  9763129.
14. Като, А.; Киётани, К.; Сакаи, Ю.; Ёсида, Т.; Нагай, Ю. (1997). «Парамиксовирус, вирус Сендай, белок V кодирует роскошную функцию, необходимую для вирусного патогенеза». Журнал ЭМБО . 16 (3): 578–587. дои : 10.1093/emboj/16.3.578. ПМЦ 1169661 . ПМИД  9034340. 
15. "Анализ торможения гемагглютинации при гриппе". 27 мая 2009 г.
16. "Анализ бицинхониновой кислоты - обзор | Темы ScienceDirect". www.sciencedirect.com . Получено 2023-08-07 .
17. Смит, ПК; Крон, РИ; Хермансон, ГТ; Маллия, АК; Гартнер, ФХ; Провенцано, МД; Фудзимото, ЕК; Гёке, НМ; Олсон, БДж; Кленк, ДК (1985-10-01). «Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты». Аналитическая биохимия . 150 (1): 76–85. doi :10.1016/0003-2697(85)90442-7. ISSN  0003-2697. PMID  3843705.
18. Патентное и торговое ведомство США. «Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты». Google Patents . Получено 2023-08-07 .
19. «Биология белка Пирса».
20. Kemeny, DM; Challacombe, SJ (1988). ELISA и другие твердофазные иммуноферментные анализы: теоретические и практические аспекты . John Wiley and Sons . ISBN 0-471-90982-3.
21. Kuby, J.; Kindt, TJ; Goldsby, RA; Osborne, BA (2007). Kuby Immunology 6-е издание . WH Freeman and Company. ISBN 978-1-4292-0211-4.
22. Родда, С. Дж.; Галличио, Х. А.; Хэмпсон, А. В. (1981). «Анализ одиночной радиальной иммунодиффузии выявляет небольшие антигенные различия среди гемагглютининов вируса гриппа». Журнал клинической микробиологии . 14 (5): 479–482. doi : 10.1128 /JCM.14.5.479-482.1981. PMC 273972. PMID  6171580. 
23. «Протоколы ПЦР/ПЦР в реальном времени».
24. «Прикладные биосистемы — США» (PDF) .
25. O'Leary, JJ; Sheils, O.; Martin, C.; Crowley, A. (2003). «Технология Taqman и полимеразная цепная реакция в реальном времени». В Crocker, J.; Murray, PG (ред.). Молекулярная биология в клеточной патологии . John Wiley and Sons . стр. 251–268. ISBN 978-0-470-84475-5.
26. Каллахан Дж. Д. и др., Использование портативного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени для быстрого обнаружения вируса ящура. J Am Vet Med Assoc. 2002 1 июня;220(11):1636-42.
27. Стивен Дж. Соуэрби, Мюррей Ф. Брум, Джордж Б. Петерсен. «Динамически изменяемые нанометровые апертуры для молекулярного зондирования» Датчики и приводы B: Химический том 123, выпуск 1 (2007), страницы 325-330
28. G. Seth Roberts, Sam Yu, Qinglu Zeng, Leslie CL Chan, Will Anderson, Aaron H. Colby, Mark W. Grinstaff, Steven Reid, Robert Vogel. «Настраиваемые поры для измерения концентраций синтетических и биологических дисперсий наночастиц» Biosensors and Bioelectronics, 31 стр. 17-25, (2012).
29. C. Degueldre, P.-Y. Favarger, Коллоидный анализ с помощью масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой отдельных частиц: исследование осуществимости, Colloids and Surfaces A, 217 (2003) 137-142.
30. C Degueldre, P.-Y Favarger, S. Wold, Анализ золотого коллоида методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой отдельных частиц в одночастичном режиме, Anal Chim Acta, 555 (2006) 263-268.
31. C. Degueldre, Анализ масс-спектроскопии индуктивно связанной плазмы отдельного вируса: комплексное исследование. Talanta, том 228 февр. (2021) 122211.
32. Stoffel, CL; Finch, R.; Christensen, K.; Edwards, D.; Rowlen, KL (2005). «Быстрое определение титра бакуловируса с помощью двухканального счетчика вирусов». Американская биотехнологическая лаборатория . 37 (22): 24–25.
33. Шерман, И. «Разрешение электронного микроскопа». The Physics Factbook . Получено 25 февраля 2010 г.
34. Steffens, WL (1998). «Использование трансмиссионной электронной микроскопии для диагностики вирусов у попугаеобразных птиц». Труды международных виртуальных конференций по ветеринарии: болезни попугаеобразных птиц . Афины, Джорджия.