stringtranslate.com

Окраска по Граму

Микрофотография грамположительного кокка и грамотрицательной палочки.
Окраска по Граму смешанных штаммов Staphylococcus aureus ( S. aureus ATCC 25923, грамположительные кокки, фиолетового цвета) и Escherichia coli ( E. coli ATCC 11775, грамотрицательные палочки, красного цвета), наиболее распространенных эталонных бактерий, окрашенных по Граму.

Окрашивание по Граму ( окрашивание по Граму или метод Грама ) — это метод окрашивания , используемый для классификации видов бактерий на две большие группы: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии . Его также можно использовать для диагностики грибковой инфекции . [1] Название происходит от датского бактериолога Ганса Христиана Грама , который разработал этот метод в 1884 году. [2]

Окрашивание по Граму позволяет дифференцировать бактерии по химическим и физическим свойствам их клеточных стенок . Грамположительные клетки имеют толстый слой пептидогликана в клеточной стенке, который удерживает первичный краситель, кристаллический фиолетовый . Грамотрицательные клетки имеют более тонкий слой пептидогликана, который позволяет кристаллическому фиолетовому смываться при добавлении этанола . Они окрашиваются в розовый или красный цвет контрастным красителем [3] , обычно сафранином или фуксином . Раствор Люголя всегда добавляется после добавления кристаллического фиолетового для усиления связей красителя с клеточной мембраной .

Окрашивание по Граму почти всегда является первым шагом в идентификации бактериальной группы. Хотя окрашивание по Граму является ценным диагностическим инструментом как в клинических, так и в исследовательских условиях, не все бактерии можно однозначно классифицировать с помощью этого метода. Это приводит к появлению грам-вариабельных и грам-неопределенных групп.

История

Метод назван в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853–1938), который разработал эту технику, работая с Карлом Фридлендером в морге городской больницы в Берлине в 1884 году. Грам разработал свою технику не с целью отличить один тип бактерий от другого, а для того, чтобы сделать бактерии более заметными в окрашенных срезах легочной ткани. [4] Грам заметил, что некоторые бактериальные клетки обладают заметной устойчивостью к обесцвечиванию. Основываясь на этих наблюдениях, Грам разработал первоначальную процедуру окрашивания по Граму, первоначально используя анилин-генциановый фиолетовый Эрлиха, йод Люголя, абсолютный спирт для обесцвечивания и бисмарковский коричневый для контрастного окрашивания. [5] Он опубликовал свой метод в 1884 году и включил в свой краткий отчет наблюдение, что брюшнотифозная палочка не удерживает краску. [6] Первоначально Грам не делал различий между грамотрицательными и грамположительными бактериями, используя свою процедуру. [5]

Использует

Окраска по Граму Candida albicans из вагинального мазка. Маленькие овальные хламидоспоры диаметром 2–4 мкм .

Окрашивание по Граму — это бактериологическая лабораторная техника [7], используемая для дифференциации видов бактерий на две большие группы ( грамположительные и грамотрицательные ) на основе физических свойств их клеточных стенок . [8] [ нужна страница ] Окрашивание по Граму также можно использовать для диагностики грибковой инфекции . [1] Окрашивание по Граму не используется для классификации архей , поскольку эти микроорганизмы дают сильно различающиеся ответы, которые не соответствуют их филогенетическим группам . [9]

Некоторые организмы являются грамвариабельными (то есть они могут окрашиваться как отрицательно, так и положительно); некоторые не окрашиваются ни одним из красителей, используемых в методе Грама, и не видны. [ необходима ссылка ]

Медицинский

Окрашивание по Граму проводится на биологических жидкостях или биопсии при подозрении на инфекцию . Окрашивание по Граму дает результаты гораздо быстрее, чем культивирование , и особенно важно, когда инфекция может существенно повлиять на лечение и прогноз пациента; примерами являются спинномозговая жидкость при менингите и синовиальная жидкость при септическом артрите . [10] [11]

Механизм окрашивания

Грамположительные бактерии, окрашенные в фиолетовый цвет (слева), и грамотрицательные бактерии, окрашенные в розовый цвет (справа)

Грамположительные бактерии имеют толстую сетчатую клеточную стенку, состоящую из пептидогликана (50–90% клеточной оболочки), и в результате окрашиваются кристаллическим фиолетовым в фиолетовый цвет, тогда как грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой (10% клеточной оболочки), поэтому не сохраняют фиолетовую окраску и контрастно окрашиваются в розовый цвет сафранином. Существует четыре основных этапа окрашивания по Граму:

  1. Нанесение первичного красителя ( кристаллического фиолетового ) на термофиксированный мазок бактериальной культуры. Термофиксация убивает некоторые бактерии, но в основном используется для прикрепления бактерий к предметному стеклу, чтобы они не вымывались во время процедуры окрашивания.
  2. Добавление йода , который связывается с кристаллическим фиолетовым и удерживает его в клетке
  3. Быстрое обесцвечивание этанолом или ацетоном
  4. Контрастное окрашивание сафранином . [12] Карболовый фуксин иногда заменяет сафранин, поскольку он более интенсивно окрашивает анаэробные бактерии, но его реже используют в качестве контркрасителя. [ 13]

Кристаллический фиолетовый (КВ) диссоциирует в водных растворах на КВ+
и хлорид ( Cl−
) ионов. Эти ионы проникают через клеточную стенку как грамположительных, так и грамотрицательных клеток. CV+
ион взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами бактериальных клеток и окрашивает клетки в фиолетовый цвет. [14]

Иодид ( I−
или я−
3) взаимодействует с CV+
и образует большие комплексы кристаллического фиолетового и йода (CV–I) во внутренних и внешних слоях клетки. Йод часто называют протравой , но он является ловушечным агентом, который предотвращает удаление комплекса CV–I и, следовательно, окрашивает клетку. [15]

При добавлении обесцвечивающего агента, такого как спирт или ацетон, он взаимодействует с липидами клеточной мембраны. [16] Грамотрицательная клетка теряет свою внешнюю липополисахаридную мембрану, а внутренний слой пептидогликана остается открытым. Комплексы CV–I вымываются из грамотрицательной клетки вместе с внешней мембраной. [17] Напротив, грамположительная клетка обезвоживается при обработке этанолом. Большие комплексы CV–I оказываются запертыми внутри грамположительной клетки из-за многослойной природы ее пептидогликана. [17] Этап обесцвечивания имеет решающее значение и должен быть правильно рассчитан по времени; краситель кристаллического фиолетового удаляется как из грамположительных, так и из отрицательных клеток, если обесцвечивающий агент остается на них слишком долго (в течение нескольких секунд). [18]

После обесцвечивания грамположительная клетка остается фиолетовой, а грамотрицательная клетка теряет свой фиолетовый цвет. [18] Контркраситель, который обычно представляет собой положительно заряженный сафранин или основной фуксин, применяется в последнюю очередь, чтобы придать обесцвеченным грамотрицательным бактериям розовый или красный цвет. [3] [19] Как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии подхватывают контркраситель. Однако контркраситель не виден на грамположительных бактериях из-за более темного кристаллического фиолетового окрашивания. [ необходима цитата ]

Примеры

Грамположительные бактерии

Окраска по Граму грамположительных стрептококков , окруженных гнойными клетками

Грамположительные бактерии обычно имеют одну мембрану ( монодерму ), окруженную толстым пептидогликаном. Этому правилу следуют два типа: Bacillota (за исключением классов Mollicutes и Negativicutes ) и Actinomycetota . [8] [20] Напротив, представители Chloroflexota (зеленые несерные бактерии) являются монодермами, но обладают тонким или отсутствующим (класс Dehalococcoidetes ) пептидогликаном и могут окрашиваться отрицательно, положительно или неопределенно; представители Deinococcota окрашиваются положительно, но являются дидермами с толстым пептидогликаном. [8] [ нужна страница ] [20]

Прочность клеточной стенки увеличивается за счет тейхоевых кислот, гликополимерных веществ, встроенных в пептидогликан. Тейхоевые кислоты играют несколько ролей, например, создают отрицательный заряд клетки, способствуют жесткости клеточной стенки и поддержанию ее формы, а также способствуют делению клеток и сопротивлению различным стрессорам, включая тепло и соль. Несмотря на плотность пептидогликанового слоя, он остается относительно пористым, что позволяет большинству веществ проникать. Для получения более крупных питательных веществ грамположительные бактерии используют экзоферменты, секретируемые внеклеточно, для расщепления макромолекул вне клетки. [21]

Исторически грамположительные формы составляли тип Firmicutes , название, которое теперь используется для самой большой группы. Он включает в себя много известных родов, таких как Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus и Clostridium . [22] Он также был расширен за счет включения Mollicutes, бактерий, таких как Mycoplasma и Thermoplasma, у которых нет клеточных стенок и поэтому они не могут быть окрашены по Граму, но произошли от таких форм. [23]

У некоторых бактерий есть клеточные стенки, которые особенно хорошо удерживают красители. Они будут выглядеть положительными при окраске по Граму, даже если они не являются близкородственными к другим грамположительным бактериям. Их называют кислотоустойчивыми бактериями , и их можно отличить от других грамположительных бактерий только с помощью специальных процедур окрашивания . [24]

Грамотрицательные бактерии

Грамотрицательные Neisseria gonorrhoeae и гнойные клетки

Грамотрицательные бактерии обычно обладают тонким слоем пептидогликана между двумя мембранами ( дидермой ). [25] Липополисахарид (ЛПС) является наиболее распространенным антигеном на поверхности клеток большинства грамотрицательных бактерий, составляя до 80% внешней мембраны E. coli и Salmonella . [26] Эти молекулы ЛПС, состоящие из О-антигена или О-полисахарида, основного полисахарида и липида А, выполняют множество функций, включая содействие отрицательному заряду клетки и защиту от определенных химических веществ. Роль ЛПС имеет решающее значение во взаимодействиях хозяина и патогена, при этом О-антиген вызывает иммунный ответ, а липид А действует как эндотоксин. [21]

Кроме того, внешняя мембрана действует как селективный барьер, регулируемый поринами, трансмембранными белками, образующими поры, которые позволяют проходить определенным молекулам. Пространство между клеточной мембраной и внешней мембраной, известное как периплазма, содержит периплазматические ферменты для обработки питательных веществ. Важным структурным компонентом, связывающим пептидогликановый слой и внешнюю мембрану, является липопротеин Брауна, который обеспечивает дополнительную стабильность и прочность бактериальной клеточной стенки. [21]

Большинство бактериальных типов являются грамотрицательными, включая цианобактерии , зеленые серные бактерии и большинство Pseudomonadota (исключения составляют некоторые представители Rickettsiales и насекомые-эндосимбионты Enterobacteriales ) . [8] [ нужна страница ] [20]

Грамвариабельные и грамнеопределенные бактерии

Некоторые бактерии после окрашивания по Граму дают грамвариабельный рисунок: видна смесь розовых и фиолетовых клеток. [17] [27] В культурах Bacillus, Butyrivibrio и Clostridium уменьшение толщины пептидогликана во время роста совпадает с увеличением количества клеток, которые окрашиваются грамотрицательно. [27] Кроме того, у всех бактерий, окрашенных по Граму, возраст культуры может влиять на результаты окрашивания. [27]

Грам-неопределенные бактерии непредсказуемо реагируют на окрашивание по Граму и, следовательно, не могут быть определены как грамположительные или грамотрицательные. Примерами служат многие виды Mycobacterium , включая Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae и Mycobacterium tuberculosis , последние два из которых являются возбудителями проказы и туберкулеза соответственно. [28] [29] Бактерии рода Mycoplasma не имеют клеточной стенки вокруг своих клеточных мембран , [10] что означает, что они не окрашиваются по методу Грама и устойчивы к антибиотикам, которые нацелены на синтез клеточной стенки. [30] [31]

Орфографическое примечание

Термин окрашивание по Граму происходит от фамилии Ганса Христиана Грама ; поэтому эпоним (Грам) пишется с заглавной буквы, а не нарицательное (пятно), как это обычно бывает с научными терминами. [32] Начальные буквы слов gram-positive и gram-negative , которые являются эпонимическими прилагательными , могут быть как заглавными G , так и строчными g , в зависимости от того, какое руководство по стилю (если таковое имеется) регулирует написанный документ. Стиль строчных букв используется Центрами США по контролю и профилактике заболеваний и другими режимами стиля, такими как стиль AMA . [33] Словари могут использовать строчные буквы, [34] [35] заглавные буквы, [36] [37] [38] [39] или оба. [40] [41] Использование заглавных букв Gram-positive или Gram-negative также распространено во многих статьях и публикациях научных журналов . [41] [42] [43] Когда статьи отправляются в журналы, каждый журнал может применять или не применять фирменный стиль к постпечатной версии. Препринтные версии содержат тот стиль, который случайно использовал автор. Даже режимы стилей, которые используют строчные буквы для прилагательных грамположительный и грамотрицательный, все еще обычно используют заглавные буквы для окраски по Граму . [ необходима ссылка ]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab "Окрашивание по Граму: медицинский тест MedlinePlus". medlineplus.gov .
  2. ^ Колко, Р. (2005). «Окрашивание по Граму». Текущие протоколы в микробиологии . Приложение 3 (1): Приложение 3C. doi :10.1002/9780471729259.mca03cs00. ISBN 978-0471729259. PMID  18770544. S2CID  32452815.
  3. ^ ab Beveridge, TJ; Davies, JA (ноябрь 1983 г.). «Клеточные ответы Bacillus subtilis и Escherichia coli на окрашивание по Граму». Журнал бактериологии . 156 (2): 846–58. doi :10.1128/JB.156.2.846-858.1983. PMC 217903. PMID  6195148 . 
  4. ^ Austrian, R. (1960 ) . «Окрашивание по Граму и этиология крупозной пневмонии, историческая справка». Bacteriological Reviews . 24 (3): 261–265. doi :10.1128/MMBR.24.3.261-265.1960. PMC 441053. PMID  13685217. 
  5. ^ ab Bartholomew, James W.; Mittwer, Tod (март 1952). "ОКРАШИВАНИЕ ПО ГРАМУ". Bacteriological Reviews . 16 (1): 1–29. doi :10.1128/br.16.1.1-29.1952. ISSN  0005-3678. PMC 180726. PMID 14925025  . 
  6. ^ Грам, Ганс Кристиан (1884). «Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten». Fortschritte der Medizin (на немецком языке). 2 : 185–189..
    Английский перевод в: Brock, TD (1999). Milestones in Microbiology 1546–1940 (2-е изд.). ASM Press. стр. 215–218. ISBN 978-1-55581-142-6.
    Перевод также доступен по адресу: Brock, TD "Pioneers in Medical Laboratory Science: Christian Gram 1884". HOSLink.com . Получено 27 июля 2010 г. .
  7. ^ Райан, К. Дж.; Рэй, К. Г., ред. (2004). Sherris Medical Microbiology (4-е изд.). McGraw Hill. стр. 232f. ISBN 978-0838585290.
  8. ^ abcd Madigan, MT; Martinko, J.; Parker, J. (2004). Brock Biology of Microorganisms (10-е изд.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 978-0-13-066271-2.
  9. ^ Беверидж, Т.Дж. (2001). «Использование окраски по Граму в микробиологии». Биотехника и гистохимия . 76 (3): 111–118. doi :10.1080/714028139. PMID  11475313.
  10. ^ ab Ryan KJ, Ray CG (редакторы) (2004). Sherris Medical Microbiology (4-е изд.). McGraw Hill. стр. 409–12. ISBN 978-0-8385-8529-0. {{cite book}}: |author=имеет общее название ( помощь )
  11. ^ Søgaard, M.; Nørgaard, M.; Schønheyder, H. (2007). «Первое уведомление о положительных культурах крови: высокая точность отчета об окраске по Граму». Журнал клинической микробиологии . 45 (4): 1113–1117. doi :10.1128/JCM.02523-06. PMC 1865800. PMID  17301283 . 
  12. ^ Блэк, Жаклин Г. (1993). Микробиология: принципы и исследования . Prentice Hall. стр. 65.
  13. ^ "Medical Chemical Corporation". Med-Chem.com . Получено 9 марта 2016 г.
  14. ^ Лебофф, Майкл (2014). Теория и применение микробиологической лаборатории (3-е изд.). Энглвуд, Колорадо: Morton Publishing Company. стр. 105. ISBN 978-1617312809.
  15. ^ "Теория пятен – Чем не является протрава". StainsFile.info . Архивировано из оригинала 9 марта 2016 . Получено 9 марта 2016 .
  16. ^ "Gram Stain". Microbugz . Austin Community College. Архивировано из оригинала 2017-05-26 . Получено 2017-05-26 .
  17. ^ abc Тим, Сэндл (21 октября 2015 г.). Фармацевтическая микробиология: основы обеспечения и контроля качества . Elsevier Science. ISBN 9780081000229. OCLC  923807961.
  18. ^ ab Харди, Джей; Мария, Санта. "Gram's Serendipitous Stain" (PDF) . Диагностика Харди . Архивировано (PDF) из оригинала 2017-03-24.
  19. ^ Davies, JA; Anderson, GK; Beveridge, TJ; Clark, HC (ноябрь 1983 г.). «Химический механизм окраски по Граму и синтез нового электронно-непрозрачного маркера для электронной микроскопии, который заменяет йодную протраву окраски». Journal of Bacteriology . 156 (2): 837–845. doi :10.1128/JB.156.2.837-845.1983. PMC 217902 . PMID  6195147. 
  20. ^ abc Brenner, Don J.; Krieg, Noel R.; Staley, James T. (26 июля 2005 г.) [1984]. Garrity, George M. (ред.). Introductory Essays. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2A (2-е изд.). New York: Springer. стр. 304. ISBN 978-0-387-24143-2. Британская библиотека № GBA561951.
  21. ^ abc Бруслинд, Линда (2019-08-01). Общая микробиология. Университет штата Орегон.
  22. ^ Гальперин, Майкл Ю. (27 декабря 2013 г.). «Геномное разнообразие спорообразующих фирмикутов». Microbiology Spectrum . 1 (2): TBS-0015-2012-. doi :10.1128/microbiolspectrum.tbs-0015-2012. ISSN  2165-0497. PMC 4306282 . PMID  26184964. 
  23. ^ Хашем, Хамс Х. «Практическая медицинская микробиология». Университет Аль-Кадисия .[ постоянная мертвая ссылка ]
  24. ^ "The Acid Fast Stain". www2.Highlands.edu . Georgia Highlands College. Архивировано из оригинала 10 июня 2017 года . Получено 10 июня 2017 года .
  25. ^ Megrian D, Taib N, Witwinowski J, Gribaldo S (2020). «Одна или две мембраны? Diderm Firmicutes бросают вызов разделению грамположительных и грамотрицательных бактерий». Молекулярная микробиология . 113 (3): 659–671. doi : 10.1111/mmi.14469 . PMID  31975449. S2CID  210882600.
  26. ^ Avila-Calderón ED, Ruiz-Palma MD, Contreras-Rodriguez A (2021). «Везикулы внешней мембраны грамотрицательных бактерий: взгляд на биогенез». Frontiers in Microbiology . 12 : 557902. doi : 10.3389/fmicb.2021.557902 . PMC 7969528. PMID  33746909 . 
  27. ^ abc Beveridge, Terry J. (март 1990 г.). «Механизм изменчивости по Граму у отдельных бактерий». Журнал бактериологии . 172 (3): 1609–1620. doi :10.1128/jb.172.3.1609-1620.1990. PMC 208639. PMID  1689718 . 
  28. ^ Блэк, Жаклин (2012). Микробиология: принципы и исследования (8-е изд.). John Wiley & Sons. стр. 68. ISBN 978-0-470-54109-8.
  29. ^ Рейнольдс, Дж.; Мойес, Р.Б.; Брейквелл, Д.П. (2009). "Приложение 3". Дифференциальное окрашивание бактерий: кислотоустойчивое окрашивание . Том. Приложение 3. стр. H. doi :10.1002/9780471729259.mca03hs15. ISBN 978-0471729259. PMID  19885935. S2CID  45685776. {{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь )
  30. ^ Lee EH, Winter HL, van Dijl JM, Metzemaekers JD, Arends JP (декабрь 2012 г.). «Диагностика и антимикробная терапия менингита, вызванного Mycoplasma hominis, у взрослых». Международный журнал медицинской микробиологии . 302 (7–8): 289–92. doi :10.1016/j.ijmm.2012.09.003. PMID  23085510.
  31. ^ Gautier-Bouchardon AV (июль 2018 г.). «Устойчивость к антимикробным препаратам у Mycoplasma spp». Microbiology Spectrum . 6 (4): 425–446. doi :10.1128/microbiolspec.ARBA-0030-2018. ISBN 9781555819798. PMID  30003864. S2CID  51616821.
  32. ^ Waddingham, Anne (28 августа 2014). Новые правила Харта: Оксфордское руководство по стилю. Oxford University Press. стр. 105. ISBN 978-0199570027.
  33. ^ "Предпочтительное использование". Руководство по стилю Emerging Infectious Diseases . Центры по контролю и профилактике заболеваний .
  34. ^ "Иллюстрированный медицинский словарь Дорланда" (32-е изд.). Elsevier . Получено 5 июня 2020 г.Используйте такие поисковые термины, как gram-negative.
  35. ^ «грам–положительный», Merriam-Webster , Encyclopaedia Britannica, Inc.
  36. ^ "Грамположительный". CollinsDictionary.com . HarperCollins.
  37. ^ "Gram stain". Lexico.com . Oxford University Press. Архивировано из оригинала 5 июня 2020 г.
  38. ^ "Грамположительные". MedicineNet .
  39. ^ "Грамотрицательные/положительные". BusinessDictionary.com . Архивировано из оригинала 2016-10-20 . Получено 2016-10-20 .
  40. ^ "грам-положительный или грамположительный". The American Heritage Dictionary . Houghton Mifflin.
  41. ^ ab "Грамположительные". Dictionary.com .
  42. ^ Браун, Лиза; Вольф, Джули М.; Прадос-Росалес, Рафаэль; Касадеваль, Артуро (2015). «Сквозь стену: внеклеточные везикулы у грамположительных бактерий, микобактерий и грибов». Nature Reviews Microbiology . 13 (10): 620–630. doi : 10.1038/nrmicro3480. PMC 4860279. PMID  26324094. 
  43. ^ Мюллер, Кристен Л. (12 июня 2015 г.). «Обнаружение грамотрицательных бактерий». Science . 348 (6240): 1218. doi :10.1126/science.348.6240.1218-o.

Внешние ссылки

На Викискладе есть медиафайлы по теме «Окрашивание по Граму» .
В Wikibook School Science есть страница по теме: Окрашивание по Граму