Эксперимент с одной молекулой — это эксперимент, который исследует свойства отдельных молекул . Исследования с одной молекулой можно сравнить с измерениями ансамбля или большой коллекции молекул, где индивидуальное поведение молекул невозможно различить, и можно измерить только средние характеристики. Поскольку многие методы измерения в биологии, химии и физике недостаточно чувствительны для наблюдения за отдельными молекулами, методы флуоресценции с одной молекулой (появившиеся с 1990-х годов для исследования различных процессов на уровне отдельных молекул) вызвали большой ажиотаж, поскольку они предоставили много новых подробностей об измеряемых процессах, которые были недоступны в прошлом. Действительно, с 1990-х годов было разработано много методов для исследования отдельных молекул. [2]
Первые эксперименты с одной молекулой были экспериментами с пэтч-клампом , проведенными в 1970-х годах, но они были ограничены изучением ионных каналов . Сегодня системы, исследуемые с использованием методов с одной молекулой, включают движение миозина на актиновых нитях в мышечной ткани и спектроскопические детали отдельных локальных сред в твердых телах. Конформации биологических полимеров были измерены с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Используя силовую спектроскопию , отдельные молекулы (или пары взаимодействующих молекул), обычно полимеры , можно механически растягивать, а их упругий отклик регистрировать в реальном времени.
В газовой фазе при сверхнизких давлениях эксперименты с отдельными молекулами проводились уже несколько десятилетий, но в конденсированной фазе они начались только в 1989 году в работе В. Э. Мёрнера и Лотара Кадора. [3] Год спустя Мишель Оррит и Жаки Бернар смогли также продемонстрировать обнаружение поглощения отдельных молекул по их флуоресценции. [4]
Многие методы позволяют наблюдать одну молекулу за раз, в частности, масс-спектрометрия , где обнаруживаются отдельные ионы. Кроме того, один из самых ранних способов обнаружения отдельных молекул появился в области ионных каналов с разработкой метода патч-кламп Эрвином Неером и Бертом Сакманном (который впоследствии получил Нобелевскую премию за свой основополагающий вклад). Однако идея измерения проводимости для наблюдения за отдельными молекулами наложила серьезные ограничения на тип систем, которые можно было наблюдать.
Флуоресценция является удобным способом наблюдения за одной молекулой за раз, в основном из-за чувствительности коммерческих оптических детекторов, способных подсчитывать отдельные фотоны. Однако, спектроскопически, наблюдение за одной молекулой требует, чтобы молекула находилась в изолированной среде и чтобы она испускала фотоны при возбуждении, что благодаря технологии обнаружения отдельных фотонов с использованием фотоумножительных трубок (ФЭУ) или лавинных фотодиодов (ЛФД) позволяет регистрировать события испускания фотонов с большой чувствительностью и временным разрешением.
В последнее время флуоресценция отдельных молекул стала предметом пристального интереса для биологической визуализации посредством маркировки биомолекул, таких как белки и нуклеотиды, для изучения ферментативной функции, которую нелегко изучить в массовом масштабе из-за тонких зависящих от времени движений в катализе и структурной реорганизации. Наиболее изученным белком был класс ферментов миозина/актина, обнаруженных в мышечных тканях. С помощью методов отдельных молекул был обнаружен и охарактеризован ступенчатый механизм во многих из этих белков.
В 1997 году обнаружение отдельных молекул было продемонстрировано с помощью поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (SERS) Катрин Кнайпп , Х. Кнайпп, И. Ван, Л. Т. Перельман и другими [5] в Массачусетском технологическом институте и независимо С. Ни и С. Р. Эмори в Университете Индианы . [6] Команда Массачусетского технологического института использовала нерезонансное рамановское возбуждение и поверхностное усиление с помощью нанокластеров серебра для обнаружения отдельных молекул крезилового фиолетового , в то время как команда Университета Индианы использовала резонансное рамановское возбуждение и поверхностное усиление с помощью наночастиц серебра для обнаружения отдельных молекул родамина 6G .
Наноманипуляторы, такие как атомно-силовой микроскоп, также подходят для экспериментов с отдельными молекулами биологического значения, поскольку они работают в том же масштабе длины, что и большинство биологических полимеров. Кроме того, атомно-силовая микроскопия (АСМ) подходит для изучения синтетических полимерных молекул. АСМ обеспечивает уникальную возможность трехмерной визуализации полимерных цепей. Например, режим касания АСМ достаточно щадящий для регистрации адсорбированных полиэлектролитных молекул (например, цепей поли(2-винилпиридина) толщиной 0,4 нм) в жидкой среде. Расположение двухцепочечной суперпозиции соответствует в этих экспериментах двойной толщине одиночной цепи (0,8 нм в случае упомянутого примера). При применении надлежащих параметров сканирования конформация таких молекул остается неизменной в течение нескольких часов, что позволяет проводить эксперименты в жидких средах с различными свойствами. [1] Кроме того, контролируя силу между наконечником и образцом, можно получать изображения высокого разрешения. [7] [8] Оптический пинцет также использовался для изучения и количественной оценки взаимодействия ДНК-белок. [7] [8]
Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул использует флуоресценцию молекулы для получения информации об ее окружении, структуре и положении. Метод дает возможность получать информацию, которая в противном случае не была бы доступна из-за усреднения ансамбля (то есть сигнал, полученный при регистрации многих молекул одновременно, представляет собой среднее свойство динамики молекул). Результаты многих экспериментов с отдельными молекулами представляют собой двухуровневые траектории .
Как и в случае флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул, метод, известный как одноканальная запись, может быть использован для получения определенной кинетической информации — в данном случае о функции ионного канала — которая недоступна при ансамблевой записи, такой как запись всей клетки. [9] В частности, ионные каналы чередуются между проводящими и непроводящими классами, которые различаются по конформации. Поэтому функциональное состояние ионных каналов может быть напрямую измерено с помощью достаточно чувствительной электроники, при условии принятия надлежащих мер предосторожности для минимизации шума. В свою очередь, каждый из этих классов может быть разделен на одно или несколько кинетических состояний, имеющих прямое отношение к базовой функции ионного канала. Выполнение этих типов исследований одиночных молекул в систематически изменяющихся условиях (например, концентрация и структура агониста, проникающий ион и/или блокатор канала, мутации в аминокислотах ионного канала) может предоставить информацию относительно взаимопревращения различных кинетических состояний ионного канала. [10] В минимальной модели для ионного канала существует два состояния : открытое и закрытое. Однако для точного представления данных часто требуются и другие состояния, включая множественные закрытые состояния, а также неактивные и/или десенсибилизированные состояния, которые являются непроводящими состояниями, которые могут возникать даже при наличии стимула. [9]
Отдельные флуорофоры могут быть химически присоединены к биомолекулам, таким как белки или ДНК, и динамика отдельных молекул может быть отслежена путем мониторинга флуоресцентного зонда. Пространственные перемещения в пределах предела Рэлея могут быть отслежены, наряду с изменениями интенсивности излучения и/или радиационного времени жизни, которые часто указывают на изменения в локальной среде. Например, маркировка отдельных молекул дала огромное количество информации о том, как моторные белки кинезина перемещаются вдоль нитей микротрубочек в мышечных клетках. Визуализация отдельных молекул в живых клетках раскрывает интересную информацию о динамике белка в его физиологической среде. Несколько биофизических параметров динамики белка могут быть количественно определены, такие как коэффициент диффузии, среднеквадратичное смещение, время пребывания, доля связанных и несвязанных молекул и механизм поиска мишени связывания белка с его целевым сайтом в живой клетке. [11]
Основная статья smFRET .
При резонансном переносе энергии флуоресценции одиночной молекулы молекула помечена (как минимум) в двух местах. Лазерный луч фокусируется на молекуле, возбуждая первый зонд. Когда этот зонд расслабляется и испускает фотон, у него есть шанс возбудить другой зонд. Эффективность поглощения фотона, испускаемого первым зондом, во втором зонде зависит от расстояния между этими зондами. Поскольку расстояние меняется со временем, этот эксперимент исследует внутреннюю динамику молекулы.
При рассмотрении данных, связанных с отдельными молекулами, обычно можно построить пропагаторы и функции плотности вероятности времени скачка первого порядка, второго порядка и т. д., тогда как из массовых экспериментов обычно получают распад корреляционной функции. [12] Из информации, содержащейся в этих уникальных функциях (полученных от отдельных молекул), можно извлечь относительно ясную картину того, как ведет себя система; например, ее кинетическую схему , или ее потенциал активности, или ее форму приведенных измерений . [13] [14] В частности, можно построить (многие свойства) пути реакции фермента при мониторинге активности отдельного фермента. [15] Кроме того, важные аспекты, касающиеся анализа данных отдельных молекул, такие как методы подгонки и тесты для однородных популяций, были описаны несколькими авторами. [9] С другой стороны, существует несколько проблем с анализом данных об отдельных молекулах, включая создание среды с низким уровнем шума и изолированных наконечников пипеток, фильтрацию некоторых оставшихся нежелательных компонентов (шума), обнаруженных в записях, а также продолжительность времени, необходимого для анализа данных (предварительная обработка, однозначное обнаружение событий, построение графиков данных, подгонка кинетических схем и т. д.).
Методы исследования отдельных молекул повлияли на оптику, электронику, биологию и химию. В биологических науках изучение белков и других сложных биологических механизмов ограничивалось ансамблевыми экспериментами, которые практически делали невозможным прямое наблюдение их кинетики. Например, только после того, как для изучения пар кинезин-миозин в мышечной ткани была использована флуоресцентная микроскопия отдельных молекул, было понято прямое наблюдение механизмов ходьбы. Однако эти эксперименты по большей части ограничивались исследованиями in vitro, поскольку полезные методы визуализации живых клеток еще не были полностью реализованы. Однако перспектива визуализации отдельных молекул in vivo [16] несет с собой огромный потенциал для прямого наблюдения за биомолекулами в нативных процессах. Эти методы часто нацелены на исследования, связанные с белками с низкой копией, многие из которых все еще находятся в стадии открытия. Эти методы также были распространены на изучение областей химии, включая картирование гетерогенных поверхностей. [17]