α-Бунгаротоксин — один из бунгаротоксинов , компонентов яда змеи -крайта ( Bungarus multicinctus ). Это тип α-нейротоксина , нейротоксичного белка, который, как известно, конкурентно и относительно необратимо связывается с никотиновым ацетилхолиновым рецептором, обнаруженным в нервно-мышечном соединении , вызывая паралич , дыхательную недостаточность и смерть жертвы. [2] Также было показано, что он играет антагонистическую роль в связывании никотинового ацетилхолинового рецептора α7 в мозге, и как таковой имеет многочисленные применения в исследованиях нейронауки.
Бунгаротоксины — это группа токсинов , которые тесно связаны с нейротоксичными белками, преимущественно присутствующими в яде крайтов . Эти токсины напрямую связаны с суперсемейством трехпалых токсинов . Среди них выделяется α-бунгаротоксин (α-BTX), представляющий собой пептидный токсин , вырабатываемый змеей Elapid Taiwanese banded krait, также известной как многополосый крайт или тайваньский или китайский крайт. [3]
Elapid, семейство тайваньских полосатых крайтов ( Bungarus multicinctus ), относится к семейству змей Elapide . Яд крайта, как и большинство ядов змей, включает комбинацию белков , которые вместе приводят к замечательному спектру неврологических последствий. Семейство змей Elapid известно своим мощным α-нейротоксичным ядом, который имеет постсинаптический механизм действия. [ необходима цитата ] Эти нейротоксины в первую очередь поражают нервную систему , блокируя передачу нервных импульсов, [4] что приводит к параличу и потенциальной смерти при отсутствии лечения. [5] [6]
Впервые многополосый крайт был описан в 1861 году ученым Эдвардом Блайтом. Он характеризовался своим отличительным черно-белым полосатым рисунком вдоль тела, с максимальной длиной 1,85 м. Этот очень ядовитый вид встречается в центральном и южном Китае и Юго-Восточной Азии. Их яд содержит различные нейротоксины , одним из которых является α-BTX. Согласно более поздним исследованиям механизма его действия, α-бунгаротоксин необратимо связывается с постсинаптическим никотиновым ацетилхолиновым рецептором (nAChR) в нервно-мышечном соединении . Таким образом, он конкурентно ингибирует действие ацетилхолина , что приводит к дыхательной недостаточности , параличу и даже смерти. [6] [7] [8]
В Южной и Юго-Восточной Азии отравление многополосым крайтом является распространенным и опасным для жизни заболеванием, если его не лечить своевременно. После укуса змеи яд впрыскивается в ткани жертвы. Он начинает диффундировать и распространяться по окружающим тканям через кровоток . Как только яд попадает в кровеносную систему , он может достичь целевых органов и тканей. В этом случае α-бунгаротоксин специально воздействует на нервную систему , нарушая передачу нервного импульса. Тем не менее, укусы крайтов обычно происходят ночью и не проявляются какими-либо местными симптомами , поэтому жертвы не знают об укусе. Это задерживает получение медицинской помощи , что делает его основной причиной смертности, связанной с отравлением крайтом . [9] [10]
Основной целью нейротоксинов является нервно-мышечное соединение скелетных мышц , где двигательное нервное окончание и никотиновый ацетилхолиновый рецептор являются основными целевыми участками. [11] Их нейротоксическое действие часто называют резистентной нейротоксичностью . Это происходит из-за повреждения нервных окончаний , что приводит к истощению ацетилхолина в нервно-мышечном соединении. Регенерация синапсов может занять несколько дней, что продлевает паралич и процесс восстановления для жертвы. [12] Кроме того, тяжесть паралича варьируется от легкой до опасной для жизни в зависимости от степени отравления, его состава и раннего терапевтического вмешательства. [13]
Терапия противоядием является в настоящее время стандартным лечением отравления змеиным ядом. В Китае производится моновалентное противоядие Bungarus multicinctus (BMMAV), а на Тайване — двухвалентное противоядие Neuro (NBAV). Оба противоядия иммунореактивны к нейротоксинам, обнаруженным в яде, включая α-BTX, которые нейтрализуют летальность яда . BMMAV специально разработан для нейтрализации яда Bungarus multicinctus , поэтому он более эффективен по сравнению с NBAV. С другой стороны, NBAV нацелен на яд нескольких видов змей, которые вызывают нейротоксические эффекты, включая Bungarus multicinctus. Использование BMMAV или NBAV может различаться в зависимости от доступности , региональных протоколов и конкретной ядовитой змеи, которая присутствует в этом районе. [12]
α-бунгаротоксин состоит из 8 кДа , одиночной полипептидной цепи, которая содержит 74 аминокислотных остатка . Эта полипептидная цепь сшита пятью дисульфидными мостиками , что классифицирует α-бунгаротоксин как α-нейротоксин типа II в пределах семейства трехпалых токсинов . Эти дисульфидные мостики образуются между определенными остатками цистеина и важны для стабильности и функционирования токсина. Кроме того, α-бунгаротоксин содержит десять остатков полуцистеина на молекулу. Специфическое расположение дисульфидных мостиков, образованных этими остатками цистеина, приводит к 11-кольцевой структуре внутри молекулы токсина. Эта 11-кольцевая структура особенно важна для взаимодействия токсина с целевыми рецепторами и модуляции нейротрансмиссии в нервно -мышечном соединении . [14] [15] [16]
Аминокислотная последовательность α-бунгаротоксина содержит высокую частоту гомодипептидов, с десятью парами, где сериновые и пролиновые дипептиды встречаются дважды в последовательности. Активный сайт токсина расположен в области от позиции 24 до позиции 45 в последовательности. Есть некоторые ключевые аминокислоты, обычно встречающиеся в этой области, которые включают цистеин , аргинин , глицин , лизин и валин . Как упоминалось ранее, цистеин имеет решающее значение для образования дисульфидных мостиков в белках. Аргинин и лизин могут участвовать во взаимодействиях с отрицательно заряженными молекулами или остатками, поэтому они могут играть роль в связывании со специфическими рецепторами или субстратами. Глицин может способствовать гибкости и конформационной динамике α-бунгаротоксина. Наконец, остаток валина может помочь сохранить гидрофобное ядро токсина. [15]
Подобно другим α-нейротоксинам в семействе трехпалых токсинов, α-бунгаротоксин демонстрирует третичную структуру , которая характеризуется тремя выступающими «пальцевыми» петлями, C-концевым хвостом и небольшим глобулярным ядром, стабилизированным четырьмя дисульфидными связями . Примечательно, что во второй петле присутствует дополнительная дисульфидная связь, облегчающая надлежащее связывание за счет подвижности кончиков пальцев I и II. Кроме того, водородные связи способствуют образованию антипараллельного β-слоя , поддерживая параллельную ориентацию второй и третьей петель. Структурная целостность трехпалого токсина сохраняется четырьмя дисульфидными мостиками, в то время как пятый мостик, расположенный на кончике второй петли, может быть уменьшен без ущерба для токсичности.
Полипептидная цепь α-бунгаротоксина показывает значительную гомологию последовательностей с другими нейротоксинами из ядов кобры и морской змеи , в частности с α-токсином из Naja nivea . Сравнивая α-бунгаротоксин с этими гомологичными токсинами из ядов кобры и морской змеи, было выявлено, что существует высокая степень консервации в определенных остатках. Например, существует 18 постоянных остатков, которые включают восемь полуцистеинов, которые наблюдаются во всех последовательностях токсинов. Следовательно, α-бунгаротоксин разделяет общие структурные мотивы с другими токсинами семейства трехпалых. Например, α-токсин кобры , эрабутоксин А [17] и кандоксин [18] содержат три смежные петли, идущие от глобулярного, небольшого и гидрофобного ядра , которое сшито четырьмя консервативными дисульфидными мостиками. Эта консервация предполагает наличие основных функциональных элементов, общих для этих нейротоксинов . [15] [16]
Наконец, обилие дисульфидных связей и ограниченная вторичная структура , наблюдаемая в α-бунгаротоксине, объясняют его исключительную стабильность, что делает его устойчивым к денатурации даже в экстремальных условиях, таких как кипячение и воздействие сильных кислот .
Из-за его очень большой и сложной структуры синтез α-бунгаротоксина представлял собой большую проблему для химиков-синтетиков. [16] Исследование, проведенное О. Бруном и др ., предложило механизм химического синтеза этого нейротоксина . [19] Он включает стратегию, использующую пептидные фрагменты и нативное химическое лигирование (NCL). Из-за его длины синтез полного линейного пептида с использованием твердофазного пептидного синтеза (SPPS) невозможен, поэтому синтез был выполнен путем выбора трех пептидных фрагментов, которые могут далее подвергаться нативному химическому лигированию. Этот метод создает нативную пептидную связь между двумя фрагментами путем реакции тиоэфира (C-конец) с цистеином (N-конец). [20] Использованная стратегия синтеза была от C-конца к N-концу. Во-первых, более короткие пептидные фрагменты синтезируются с помощью автоматизированного SPPS. Первые два пептида имеют точку лигирования Trp-Cys, тогда как лигирование с последним фрагментом происходит в точке лигирования Gly-Cys. Кроме того, в этом исследовании была введена алкиновая функциональность на N-конце пептидной цепи. Это позволяет конъюгировать различные молекулы, такие как флуорофоры, посредством биоортогональных реакций. С помощью флуоресцентной маркировки химически синтезированного пептида было показано, что он оказывает такое же действие и функциональность на никотиновые рецепторы, как и природный α-бунгаротоксин. [19]
Из-за сложного химического синтеза нейротоксина большинство исследований проводились с использованием очищенной формы. Чтобы исследовать эффекты α-бунгаротоксина, токсин необходимо выделить из яда змеи-элапид. Очистка полипептида проводится с помощью колоночной хроматографии . Сначала яд растворяют в буфере ацетата аммония, а затем загружают в колонку CM-Sephadex. Элюирование соединения выполняется в два различных этапа с использованием буфера ацетата аммония со скоростью потока 35 нл/ч. Эти этапы включают использование двух линейных градиентов буферов при повышении pH. [21]
α-Бунгаротоксин является пептидом, поэтому он проходит путь синтеза белка, включающий транскрипцию и трансляцию. Конкретные гены, кодирующие белок, транскрибируются в мРНК, которая затем транслируется через рибосомы, что приводит к синтезу препропептида. Наконец, происходят посттрансляционная модификация и сворачивание. Зрелый пептид хранится в ядовитой железе до отравления, когда он высвобождается.
Яд змей содержит многочисленные белки и пептидные токсины, которые проявляют высокое сродство и специфичность к более широкому диапазону рецепторов. [23] α-Бунгаротоксин является антагонистом никотиновых рецепторов, который необратимо связывается с рецептором, ингибируя действие ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях. Никотиновые рецепторы являются одним из двух подтипов холинергических рецепторов, которые реагируют на нейротрансмиттер ацетилхолин . [24]
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChR) являются лиганд-зависимыми ионными каналами , входящими в состав ионотропных рецепторов . Когда лиганд связан с ним, он регулирует возбудимость, контролируя поток ионов во время потенциала действия во время нейротрансмиссии, в первую очередь посредством активации потенциал-зависимых ионных каналов при деполяризации плазматической мембраны. Деполяризация вызывается притоком катионов, в основном ионов натрия. Для общей модуляции клеточной возбудимости необходим приток ионов натрия и отток ионов калия во внутриклеточное пространство. [25]
В центральной и периферической нервной системе α-бунгаротоксин действует, вызывая паралич скелетных мышц путем связывания с подтипом никотиновых рецепторов α7. α-Нейротоксины известны как «кураремиметические токсины» из-за их эффектов, схожих с действием яда для стрел тубокурарина . Разница между α-нейротоксинами и алкалоидами кураре заключается в том, что они связываются необратимо и обратимо специфически. α-Нейротоксины блокируют действие ацетилхолина (АХ) на постсинаптической мембране, необратимо ингибируя поток ионов. [26]
Из того же семейства токсинов бунгаротоксинов (BTX), было показано, что κ-BTX действует постсинаптически на нейрональные никотиновые рецепторы α3 и α4 с небольшим эффектом на мышечные nAChR, на которые нацелен α-BTX. Напротив, β- и γ-BTX действуют пресинаптически, уменьшая высвобождение ACh. Важно отметить, что нейротоксины названы в зависимости от типа рецептора, на который они нацелены. [26]
Никотиновые рецепторы состоят из пяти субъединиц каждый и содержат два участка связывания для нейротоксинов змеиного яда.[20] α7-nAChR представляет собой гомопентамер, состоящий из пяти идентичных субъединиц α7. Известно, что α7-рецептор имеет более высокую проницаемость Ca2+ по сравнению с другими никотиновыми рецепторами. Изменения Ca2+ внутриклеточно могут активировать важные клеточные пути, такие как путь STAT или сигнализация NF-κB . [27]
Согласованность с экспериментальными данными по количеству токсина на рецептор очевидна в наблюдении, что одиночная молекула токсина достаточна для ингибирования открытия канала. [28] Некоторые вычислительные исследования механизма ингибирования с использованием динамики нормального режима [29] предполагают, что скручивающее движение, вызванное связыванием ACh, может быть ответственным за открытие пор и что это движение ингибируется связыванием токсина. [29] [30]
В следующем разделе описывается ADME (абсорбция, распределение, метаболизм и выведение) α-бунгаротоксина. Важно отметить, что имеется ограниченная информация о фармакокинетике этого нейротоксина . Необходимы дополнительные исследования, чтобы полностью понять метаболизм этого нейротоксина внутри организма.
Всасывание : α-бунгаротоксин попадает в организм после отравления в кровоток в месте укуса. Через яд в организм попадает смесь белков и различных молекул.
Распределение : Попав в кровоток, α-бунгаротоксин циркулирует по всему телу. На его распределение могут влиять такие факторы, как кровоток, проницаемость тканей и наличие связывающих белков. Кроме того, зная, что он связывается с nAChR, можно предсказать, где будет присутствовать нейротоксин: нервно-мышечные соединения , автономные ганглии , периферические нервы и мозговое вещество надпочечников . Одним из основных мест его расположения будет также центральная нервная система (ЦНС), включая мозг . Такие определенные области, как гиппокамп , кора головного мозга и базальные ганглии, содержат эти рецепторы. [31]
Метаболизм : Метаболические пути этого нейротоксина еще не полностью изучены, однако считается, что он метаболизируется в печени . Исследование метаболизма яда является сложной задачей из-за множества компонентов, присутствующих в нем. Токсины, которые не связаны, могут подвергаться элиминации посредством опсонизации ретикулоэндотелиальной системой, в основном с участием печени и почек, или они могут подвергаться деградации посредством клеточной интернализации, облегчаемой лизосомами . [32]
Выведение : белки и пептиды обычно выводятся через печень и почки . В печени присутствующие аминокислоты подвергаются трансаминированию. Таким образом аминокислоты превращаются в аммиак и кетокислоты. Наконец, эти вещества выводятся через почки. [33]
Однако важно учитывать, что α-бунгаротоксин необратимо связывается с рецепторами, что приводит к очень низкой скорости метаболизма и выведения, поскольку большая часть нейротоксина будет присутствовать в местах расположения рецепторов. [24]
α-бунгаротоксин является одним из наиболее хорошо охарактеризованных змеиных токсинов, с его высоким сродством и специфичностью к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам. Он является конкурентным антагонистом nAChR, где он необратимо и конкурентно блокирует рецептор в местах связывания ацетилхолина. [34] Он связывается с субъединицей α1, содержащейся в мышечных nAChR, а также с подмножествами нейрональных nAChR, такими как α7-α10. Кроме того, было показано, что α-бунгаротоксин связывается и блокирует подмножество рецепторов ГАМК A , где субъединицы β3 соединяются друг с другом. Имея эти знания в виду, исследователи могут использовать α-бунгаротоксин в качестве экспериментального инструмента для изучения свойств холинергических рецепторов . [26]
Кроме того, зная различные и специфические сайты связывания , исследователи могут визуализировать и отслеживать локализацию и динамику рецепторов внутри клеток. Было показано, что эта техника проста с использованием 13- аминокислотного (WRYYESSLEPYPD) [35] мимотопа , который образует сайт связывания α-бунгаротоксина с высоким сродством с рецепторами. [36]
Он широко использовался в исследованиях для изучения локализации и распределения этих рецепторов. С помощью таких методов, как флуорофорная или ферментная конъюгация с последующей микроскопией или иммуногистохимическим окрашиванием , соответственно, можно получить представление о сложной организации и функции нервной системы. С помощью упомянутых методов исследователи могут работать над разработкой лекарств и понимать механизм заболевания. Они могут идентифицировать потенциальные цели лекарств , избирательно регулируя активность определенных рецепторов. Поэтому, наблюдая, как ведут себя рецепторы при контакте с α-бунгаротоксином по сравнению с отсутствием токсина, исследователи могут изучить механизм действия токсина.
α-Бунгаротоксин доступен для покупки у нескольких биотехнологических компаний, таких как Sigma-Aldrich или Biotium. Исследователи могут купить его там, чтобы провести различные исследования токсина.
Что касается биодоступности , исследователи провели исследование спинного мозга во время эмбрионального развития эмбрионов цыплят. Они обнаружили, что связывание α-бунгаротоксина было специфическим и насыщаемым в диапазоне концентраций 1-34 мМ. Это означает, что по мере увеличения концентрации α-бунгаротоксина сайт связывания становился все более и более ограниченным. Достигая максимального числа при 34 мМ. Как только больше не было доступных сайтов связывания, никотин вел себя конкурентным образом и выталкивал уже связанный α-бунгаротоксин. Еще одно, что они обнаружили, было то, что константа диссоциации (Kd) составляла 8,0 нМ — концентрация α-бунгаротоксина, при которой половина сайта связывания была занята. Более того, максимальная связывающая способность (Bmax) оказалась равной 106 +/- 12 фмоль/мг — максимальное количество сайтов связывания, доступных на единицу белка. Наконец, экзогенно вводимый α-бунгаротоксин проникает в ткань спинного мозга и связывается с ее специфическими участками через 7 дней. [37]
Эффективность α-бунгаротоксина можно оценить, проанализировав его связывающую аффинность . Он влияет на то, как сигнал передается в скелетном нервно-мышечном соединении, связываясь с постсинаптическими nAChR с высокой аффинностью. Сродство токсина к этому рецептору измеряется константой диссоциации (Kd), которая варьируется от 10-11 до 10-9 M. Помимо связывания со скелетными нервно-мышечными соединениями, он может специфически связываться с различными подмножествами нейронов, такими как α7. Эта связывающая аффинность лишь немного ниже, при этом Kd измеряется в диапазоне от 10-9 до 10-8 M. [38]
Его также можно проанализировать через ингибирование рецепторов, в частности, ингибируя действие ацетилхолина на nAChR. В одном исследовании было обнаружено, что 5 микрограмм/мл токсина полностью блокируют потенциал концевой пластинки и внеконтактную ацетилхолиновую чувствительность поверхностных волокон в течение приблизительно 35 минут в нормальных и хронически денервированных мышцах. Они провели период вымывания продолжительностью 6,5 часов, что привело к частичному восстановлению потенциала концевой пластинки с амплитудой 0,72 ± 0,033 мВ в нормальных мышцах. В денервированных мышцах наблюдалось частичное восстановление чувствительности к ацетилхолину с амплитудой 41,02 ± 3,95 мВ/нКл по сравнению с контрольной амплитудой 1215 ± 197 мВ/нКл. В этом же исследовании также было обнаружено, что небольшая популяция ацетилхолиновых рецепторов (1% от общей популяции) обратимо реагирует с α-бунгаротоксином. С токсином одновременно в нормальных мышцах использовали либо 20 микроМ карбамилхолина , либо декаметония . После того, как токсин и препарат были вымыты, мышца восстановила подергивание до контрольных уровней в течение 2 часов. [39]
Восприимчивость различных видов к яду крайта, который содержит альфа-бунгаротоксин, варьируется в зависимости от их генетического состава . α-бунгаротоксин лучше всего связывается с альфа-субъединицей ацетилхолина, содержащей остатки ароматических аминокислот в положениях 187 и 189, например, землеройки, кошки и мыши. У таких видов, как люди и ежи, которые имеют неароматические остатки аминокислот в тех же положениях, наблюдается пониженное сродство связывания α-бунгаротоксина. Наконец, змеи и мангусты имеют специфические замены аминокислот в 187, 189 и 194 альфа-субъединицах, что делает связывание токсина несуществующим. [40]
У людей воздействие α-бунгаротоксина может привести к различным симптомам, таким как головная боль, головокружение, потеря сознания, нарушения зрения и речи, а иногда и судороги. Начало сильной боли в животе и мышечного паралича в течение 10 часов, которые могут длиться в течение 4 дней. Наконец, паралич дыхания может привести к смерти. [41] Кроме того, это может также привести к легким симптомам, таким как дерматит и аллергические реакции, или более сильным симптомам, таким как свертывание крови , диссеминированное внутрисосудистое свертывание , повреждение тканей и кровоизлияние . [42]
На животных были проведены исследования для анализа влияния α-бунгаротоксина на животных. Одно исследование показало, что этот токсин вызывает паралич у кур, блокируя нервно-мышечную передачу на двигательной концевой пластинке. Это привело к мышечной слабости и в конечном итоге к параличу. [43]
В древние времена эти яды уже были широко распространены по всему миру. Тогда народная медицина использовала растительные и биоактивные ингибиторные соединения для лечения укусов ядовитых животных, таких как змеи и скорпионы. Этот подход оказался успешным в предотвращении отравления , эффективно смягчая вредное воздействие яда на жертв. Сегодня лечение укусов крайтов включает противоядие , которое может привести к различным нежелательным и потенциально опасным для жизни побочным эффектам, таким как тошнота, крапивница , гипотония , цианоз и тяжелые аллергические реакции. [42]
α-Бунгаротоксин принадлежит к группе бунгаротоксинов, которые являются типом ядовитых белков, содержащихся в яде крайтов — одной из шести самых смертоносных змей в Азии. Их укус может привести к параличу дыхания и смерти. [42] α-Бунгаротоксин необратимо и конкурентно связывается с мышечными и нейронными ацетилхолиновыми рецепторами. Паралич происходит из-за того, что блокируется нервно-мышечная передача на постсинаптическом участке.
Значения LD 50 , представляющие собой летальную дозу, необходимую для того, чтобы вызвать смерть у 50%, были изучены на мышах с использованием различных путей введения. Подкожное введение показало, что для убийства 50% мышей необходимо 0,108 мг/кг. Внутривенное введение привело к немного более высокому значению LD50, равному 0,113 мг/кг. Однако при внутрибрюшинном введении значение LD50 составило 0,08 мг/кг. Эти значения могут помочь в оценке риска токсина. [44]