Κ-казеин , или каппа-казеин , — это белок молока млекопитающих, участвующий в нескольких важных физиологических процессах. Химозин (содержится в сычужном ферменте ) расщепляет K-казеин на нерастворимый пептид (пара-каппа-казеин) и водорастворимый гликомакропептид (ГМП). ГМП отвечает за повышенную эффективность пищеварения, предотвращение гиперчувствительности новорожденных к потребляемым белкам и ингибирование желудочных патогенов. [1] Человеческий ген κ-казеина — CSN3 .
Казеины представляют собой семейство фосфопротеинов ( αS1 , αS2, β , κ), которые составляют почти 80% белков коровьего молока [3] и которые образуют растворимые агрегаты, известные как «казеиновые мицеллы», в которых молекулы κ-казеина стабилизируют структуру. Существует несколько моделей, которые объясняют пространственную конформацию казеина в мицеллах. [4] Одна из них предполагает, что мицеллярное ядро образовано несколькими субмицеллами, периферия которых состоит из микроворсинок κ-казеина [5] [6] Другая модель предполагает, что ядро образовано казеин-связанными фибриллами. [7] Наконец, самая последняя модель [8] предполагает двойную связь между казеинами для того, чтобы произошло гелеобразование. Все 3 модели рассматривают мицеллы как коллоидные частицы, образованные казеиновыми агрегатами, обернутыми в растворимые молекулы κ-казеина. Молокосвертывающие протеазы воздействуют на растворимую часть, κ-казеин, тем самым создавая нестабильное мицеллярное состояние, которое приводит к образованию сгустка. [9]
Химозин (EC 3.4.23.4) — это аспарагиновая протеаза , которая специфически гидролизует пептидную связь в Phe105-Met106 κ-казеина и считается наиболее эффективной протеазой для сыродельной промышленности. [10] Однако существуют молокосвертывающие протеазы, способные расщеплять другие пептидные связи в цепи κ-казеина, такие как эндотиапепсин, вырабатываемый Endothia parasitica . [11] Существует также несколько молокосвертывающих протеаз, которые, будучи способными расщеплять связь Phe105-Met106 в молекуле κ-казеина, также расщепляют другие пептидные связи в других казеинах, таких как те, которые вырабатываются Cynara cardunculus [6] [12] [13] или даже бычий химозин. [14] Это позволяет производить различные сыры с разнообразными реологическими и органолептическими свойствами.
Процесс свертывания молока состоит из трех основных фаз: [15]
Каждый шаг следует разному кинетическому шаблону, ограничивающим шагом в свертывании молока является скорость деградации κ-казеина. Кинетический шаблон второго шага процесса свертывания молока зависит от кооперативной природы мицеллярной флокуляции, [16] [13] тогда как реологические свойства образующегося геля зависят от типа действия протеаз, типа молока и шаблонов протеолиза казеина. [13] На общий процесс влияют несколько различных факторов, таких как pH или температура. [12] [9]
Традиционный способ количественной оценки данного фермента свертывания молока [17] использует молоко в качестве субстрата и определяет время, прошедшее до появления молочных сгустков. Однако свертывание молока может происходить и без участия ферментов из-за изменений физико-химических факторов, таких как низкий pH или высокая температура. [6] [3] [9] Следовательно, это может привести к запутанным и невоспроизводимым результатам, особенно когда ферменты имеют низкую активность. В то же время классический метод недостаточно специфичен с точки зрения установления точного начала гелеобразования молока, так что определение вовлеченных ферментных единиц становится сложным и неясным. Кроме того, хотя сообщалось, что гидролиз κ-казеина следует типичной кинетике Михаэлиса-Ментен , [15] его трудно определить с помощью классического анализа свертывания молока.
Чтобы преодолеть это, было предложено несколько альтернативных методов, таких как определение диаметра гало в агаризованном молоке, [17] колориметрическое измерение, [18] или определение скорости деградации казеина, предварительно помеченного либо радиоактивным индикатором [19], либо соединением флуорохрома . [20] Все эти методы используют казеин в качестве субстрата для количественной оценки протеолитической или молокосвертывающей активности.
Κ-казеин, помеченный флуорохромом флуоресцеинизотиоцианатом ( FITC ) для получения производного флуоресцеинтиокарбамоила ( FTC ). Этот субстрат используется для определения активности протеаз в свертываемости молока. [21]
Метод FTC-κ-казеина позволяет точно и достоверно определять κ-казеинолитическую деградацию, первый этап в процессе свертывания молока. Этот метод является результатом модификации метода, описанного SS Twining (1984). Основная модификация заключалась в замене ранее используемого субстрата ( казеина ) на κ-казеин, меченный флуорохромом флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), для получения производного флуоресцеинтиокарбамоила (FTC). Эта вариация позволяет количественно определять молекулы κ-казеина, деградировавшие более точно и специфично, обнаруживая только те ферменты, которые способны деградировать такие молекулы. Однако метод, описанный Twining (1984), был разработан для обнаружения протеолитической активности значительно большего числа ферментов. FTC-κ-казеин позволяет обнаруживать различные типы протеаз на уровнях, когда свертывание молока еще не очевидно, демонстрируя его более высокую чувствительность по сравнению с используемыми в настоящее время процедурами анализа. Поэтому метод может найти применение в качестве индикатора при очистке или характеристике новых ферментов свертывания молока.