Вакуолярная АТФаза ( V-АТФаза ) — высококонсервативный эволюционно древний фермент с удивительно разнообразными функциями в эукариотических организмах. [1] V-АТФазы подкисляют широкий спектр внутриклеточных органелл и перекачивают протоны через плазматические мембраны многочисленных типов клеток. V-АТФазы соединяют энергию гидролиза АТФ с транспортом протонов через внутриклеточные и плазматические мембраны эукариотических клеток. Обычно ее рассматривают как полярную противоположность АТФ-синтазе, поскольку АТФ-синтаза — это протонный канал, который использует энергию из протонного градиента для производства АТФ. Однако V-АТФаза — это протонный насос, который использует энергию из гидролиза АТФ для производства протонного градиента.
Археотипная АТФаза ( А-АТФаза ) — это родственная группа АТФаз, обнаруженных в археях , которые часто работают как АТФ-синтаза . Она образует клад V/A-АТФазу с V-АТФазой. Большинство членов любой из групп перемещают протоны ( H+
), но некоторые члены эволюционировали, чтобы использовать ионы натрия ( Na+
) вместо.
V-АТФазы обнаружены в мембранах многих органелл, таких как эндосомы , лизосомы и секреторные везикулы, где они играют ряд ролей, имеющих решающее значение для функционирования этих органелл. Например, протонный градиент через вакуолярную мембрану дрожжей, создаваемый V-АТФазами, обеспечивает поглощение кальция в вакуоль через H+
/Калифорния2+
Система антипортера. [2] При синаптической передаче в нейрональных клетках V-АТФаза подкисляет синаптические пузырьки. [3] Норадреналин проникает в пузырьки с помощью V-АТФазы [ требуется ссылка ] .
V-АТФазы также обнаружены в плазматических мембранах самых разных клеток, таких как интеркалированные клетки почек , остеокласты (клетки, резорбирующие кость), макрофаги , нейтрофилы , сперматозоиды , клетки средней кишки насекомых и некоторые опухолевые клетки. [4] V-АТФазы плазматической мембраны участвуют в таких процессах, как гомеостаз pH , сопряженный транспорт и метастазирование опухолей . V-АТФазы в акросомальной мембране спермы подкисляют акросому . Это подкисление активирует протеазы, необходимые для бурения плазматической мембраны яйцеклетки . V-АТФазы в плазматической мембране остеокласта перекачивают протоны на поверхность кости, что необходимо для резорбции кости. В интеркалированных клетках почек V-АТФазы перекачивают протоны в мочу , обеспечивая реабсорбцию бикарбоната в кровь. Кроме того, другие разнообразные биологические процессы, такие как доставка токсинов, проникновение вирусов, мембранное нацеливание, апоптоз, регуляция цитоплазматического pH, протеолитический процесс и подкисление внутриклеточных систем, играют важную роль в V-АТФазах. [5]
V-АТФазы также играют важную роль в развитии морфогенеза клеток. Нарушение гена vma-1, который кодирует каталитическую субъединицу (A) фермента, серьезно ухудшает скорость роста, дифференциации и способность производить жизнеспособные споры у грибка Neurospora crassa. [6]
Лучше всего охарактеризована дрожжевая V-АТФаза. По крайней мере тринадцать субъединиц идентифицированы для формирования функционального комплекса V-АТФазы, состоящего из двух доменов. Субъединицы принадлежат либо к домену V o ( мембранно-ассоциированные субъединицы, строчные буквы на рисунке), либо к домену V 1 (периферически-ассоциированные субъединицы, заглавные буквы на рисунке).
V 1 включает восемь субъединиц, AH, с тремя копиями каталитических субъединиц A и B, тремя копиями статорных субъединиц E и G и одной копией регуляторных субъединиц C и H. Кроме того, домен V 1 также содержит субъединицы D и F, которые образуют центральную ось ротора. [7] Домен V 1 содержит тканеспецифические изоформы субъединиц, включая B, C, E и G. Мутации в изоформе B1 приводят к человеческому заболеванию дистальный почечный канальцевый ацидоз и сенсоневральная глухота.
Домен V o содержит шесть различных субъединиц, a, d, c, c', c", и e, причем стехиометрия кольца c все еще является предметом споров, поскольку для V-АТФазы табачного бражника ( Manduca sexta ) постулируется декамер. Домен V o млекопитающих содержит тканеспецифические изоформы для субъединиц a и d, в то время как V-АТФаза дрожжей содержит две органеллоспецифические изоформы субъединиц a, Vph1p и Stv1p. Мутации в изоформе a3 приводят к заболеванию человека — младенческому злокачественному остеопетрозу , а мутации в изоформе a4 приводят к дистальному почечному канальцевому ацидозу, в некоторых случаях с сенсоневральной глухотой.
Домен V 1 отвечает за гидролиз АТФ, тогда как домен V o отвечает за транслокацию протонов. Гидролиз АТФ в каталитических сайтах связывания нуклеотидов на субъединице A запускает вращение центрального стебля, состоящего из субъединиц D и F, который, в свою очередь, запускает вращение ствола субъединиц c относительно субъединицы a. Сложная структура V-АТФазы была выявлена с помощью структуры комплексов M. Sexta и Yeast, которые были решены с помощью одночастичной крио-ЭМ и негативного окрашивания соответственно. [8] [9] [10] Эти структуры показали, что V-АТФаза имеет сеть из 3 статоров, связанных воротником плотности, образованным субъединицами C, H и a, которые, разделяя домены V 1 и V o , не взаимодействуют с центральной осью ротора, образованной субъединицами F, D и d. Вращение этой центральной оси ротора, вызванное гидролизом АТФ в каталитических доменах AB, приводит к движению ствола субъединиц c мимо субъединицы a, что приводит к транспорту протонов через мембрану. Джонсоном была предложена стехиометрия двух протонов, транслоцированных для каждого гидролизованного АТФ. [11]
В дополнение к структурным субъединицам дрожжевой V-АТФазы были идентифицированы ассоциированные белки, необходимые для сборки. Эти ассоциированные белки необходимы для сборки домена V o и называются Vma12p, Vma21p и Vma22p. [12] [13] [14] [15] Два из трех белков, Vma12p и Vma22p, образуют комплекс, который временно связывается с Vph1p (субъединица a), чтобы способствовать ее сборке и созреванию. [14] [16] [17] [18] Vma21p координирует сборку субъединиц V o , а также сопровождает домен V o в везикулы для транспортировки в аппарат Гольджи . [19]
Домен V 1 V-АТФазы является местом гидролиза АТФ. В отличие от V o , домен V 1 является гидрофильным. [5] Этот растворимый домен состоит из гексамера чередующихся субъединиц A и B, центрального ротора D, периферических статоров G и E и регуляторных субъединиц C и H. Гидролиз АТФ приводит к конформационным изменениям в шести интерфейсах A|B и, следовательно, вращению центрального ротора D. В отличие от АТФ-синтазы, домен V 1 не является активной АТФазой при диссоциации.
V-АТФаза (вакуолярная АТФаза) C представляет собой C-концевую субъединицу, которая является частью комплекса V1 и локализуется на границе между комплексами V1 и Vo. [21]
Субъединица C играет важную роль в контроле сборки V-АТФазы, выступая в качестве гибкого статора, который удерживает вместе каталитический (V1) и мембранный (VO) секторы фермента. [22] Высвобождение субъединицы C из комплекса АТФазы приводит к диссоциации субкомплексов V1 и Vo, что является важным механизмом в контроле активности V-АТФазы в клетках . По сути, создавая высокий электрохимический градиент и низкий pH, это дает ферменту возможность создавать больше АТФ.
Эти связанные субъединицы составляют стебель(и) A/V-АТФазы. Они важны для сборки и могут функционировать как толкатели в активности. E имеет колпачок для соединения с A/B, а G — нет. [20] Вероятно, они произошли от одного белка путем дупликации гена . [23]
Субъединица H участвует только в активности, а не в сборке. Эта субъединица также действует как ингибитор свободных субъединиц V1; она останавливает гидролиз АТФ, когда V1 и Vo диссоциируют. [24]
Домен V o отвечает за транслокацию протонов. В отличие от синтазы АТФ F-типа , домен V o обычно транспортирует протоны против их собственного градиента концентрации. Вращение домена V o транспортирует протоны в движении, скоординированном с доменом V 1 , который отвечает за гидролиз АТФ. Домен V o является гидрофобным и состоит из нескольких диссоциируемых субъединиц. [5] Эти субъединицы присутствуют в домене V o , делая его функциональной транслоказой протонов; они описаны ниже.
Субъединица 116kDa (или субъединица a) и субъединица I находятся в комплексе Vo или Ao V- или A-АТФазы соответственно. Субъединица 116kDa представляет собой трансмембранный гликопротеин, необходимый для сборки и протонной транспортной активности комплекса АТФазы. Существует несколько изоформ субъединицы 116kDa, что обеспечивает потенциальную роль в дифференциальном нацеливании и регуляции V-АТФазы для определенных органелл.
Функция субъединицы 116 кДа не определена, но ее предполагаемая структура состоит из 6–8 трансмембранных секторов, что позволяет предположить, что она может функционировать аналогично субъединице a FO.
Субъединица d в V-АТФазах, называемая субъединицей C в A-АТФазах, является частью комплекса Vo. Они помещаются в середину кольца c, поэтому считаются функционирующими как ротор. У эукариот существуют две версии этой субъединицы, d/d1 и d2. [25]
У млекопитающих d1 ( ATP6V0D1 ) является повсеместно экспрессируемой версией, а d2 ( ATP6V0D2 ) экспрессируется только в определенных типах клеток. [25]
Подобно АТФ-синтазе F-типа, трансмембранная область V-АТФазы включает кольцо трансмембранных субъединиц, которые в первую очередь отвечают за транслокацию протонов. Однако, в отличие от АТФ-синтазы F-типа, V-АТФаза имеет несколько связанных субъединиц в c-кольце; у грибов, таких как дрожжи, есть три связанных субъединицы (с различной стехиометрией), а у большинства других эукариот их две.
Дрожжевые V-АТФазы не собираются, если какой-либо из генов, кодирующих субъединицы, удален, за исключением субъединиц H и c". [26] [27] [28] Без субъединицы H собранная V-АТФаза неактивна, [13] [29] а потеря субъединицы c" приводит к рассоединению ферментативной активности. [27]
Точные механизмы, посредством которых собирается V-АТФаза, все еще остаются спорными, с доказательствами, предполагающими две различные возможности. Мутационный анализ и анализы in vitro показали, что предварительно собранные домены V o и V 1 могут объединяться, образуя один комплекс в процессе, называемом независимой сборкой. Поддержка независимой сборки включает выводы о том, что собранный домен V o может быть обнаружен в вакуоли при отсутствии домена V 1 , тогда как свободные домены V 1 могут быть обнаружены в цитоплазме , а не в вакуоли . [30] [31] Напротив, эксперименты с импульсным преследованием in vivo выявили ранние взаимодействия между субъединицами V o и V 1 , а именно субъединицами a и B, что предполагает, что субъединицы добавляются поэтапно, образуя единый комплекс в согласованном процессе сборки. [32]
Относительно новая техника, называемая воскрешением предкового гена, пролила новый свет на эволюционную историю V-АТФазы. Было показано, как структура V-АТФазы предковой формы, состоящая из двух различных белков, эволюционирует в версию грибов с тремя различными белками. [33] [34] [35] АТФаза V-типа похожа на архейную (так называемую) АТФ-синтазу А-типа, факт, который подтверждает архейное происхождение эукариот (как гипотеза эоцитов , см. также Lokiarchaeota ). Исключительное возникновение некоторых линий архей с F-типом и некоторых линий бактерий с A-типом АТФазы соответственно рассматривается как результат горизонтального переноса генов . [36]
Известно, что V-АТФазы специфически ингибируются макролидными антибиотиками, такими как конканамицин (CCA) и балифомицин A 1 . [37] In vivo регуляция активности V-АТФазы осуществляется путем обратимой диссоциации домена V 1 от домена V o . После первоначальной сборки как насекомые Manduca sexta , так и дрожжевые V-АТФазы могут обратимо разбираться на свободные домены V o и V 1 после 2-5-минутной депривации глюкозы. [30] Обратимая разборка может быть общим механизмом регуляции активности V-АТФазы, поскольку она существует у дрожжей и насекомых. Предполагается, что повторная сборка может осуществляться с помощью комплекса, называемого RAVE (регулятор H+
-АТФаза вакуолярных и эндосомальных мембран). [38] Разборка и повторная сборка V-АТФаз не требует синтеза нового белка, но требует неповрежденной сети микротрубочек . [39]
Остеопетроз — это общее название, которое представляет собой группу наследственных состояний, при которых наблюдается дефект остеокластической резорбции кости . У людей встречается как доминантный, так и рецессивный остеопетроз. [40] [41] Аутосомно-доминантный остеопетроз проявляется легкими симптомами у взрослых, испытывающих частые переломы костей из-за хрупкости костей. [40] Более тяжелая форма остеопетроза называется аутосомно-рецессивным инфантильным злокачественным остеопетрозом. [41] [42] [43] Были идентифицированы три гена, которые отвечают за рецессивный остеопетроз у людей. Все они напрямую участвуют в путях генерации и секреции протонов, которые необходимы для резорбции кости. Один ген — карбоангидраза II (CAII), который при мутации вызывает остеопетроз с почечным канальцевым ацидозом (тип 3). [44] Мутации гена хлоридного канала ClC7 также приводят как к доминантному, так и к рецессивному остеопетрозу. [40] Примерно у 50% пациентов с рецессивным младенческим злокачественным остеопетрозом имеются мутации в изоформе субъединицы a3 V-АТФазы. [42] [45] [46] У людей было выявлено 26 мутаций в изоформе субъединицы V-АТФазы a3, обнаруженной в остеокластах, которые приводят к заболеванию костей аутосомно-рецессивному остеопетрозу. [42] [41] [45] [47]
Важность активности V-АТФазы в секреции протонов в почках подчеркивается наследственным заболеванием дистальным почечным канальцевым ацидозом . Во всех случаях почечный канальцевый ацидоз является результатом нарушения нормальных почечных механизмов, которые регулируют системный pH. Существует четыре типа почечного канальцевого ацидоза. Тип 1 — дистальный почечный канальцевый ацидоз, который является результатом неспособности кортикального собирательного протока подкислять мочу ниже pH 5. [48] У некоторых пациентов с аутосомно-рецессивным dRTA также наблюдается сенсоневральная потеря слуха . [49] Наследование этого типа RTA является результатом либо мутаций в изоформе B1 субъединицы V-АТФазы или изоформе a4, либо мутаций полосы 3 (также называемой AE1), обменника Cl-/HCO3-. [49] [50] [51] Двенадцать различных мутаций в изоформе B1 V-АТФазы [52] и двадцать четыре различных мутации в a4 приводят к dRTA. [52] [49] Исследования полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией показали экспрессию субъединицы a4 в интеркалированной клетке почки и в улитке . [52] dRTA, вызванный мутациями в гене субъединицы a4, в некоторых случаях может быть связан с глухотой из-за неспособности нормально подкислять эндолимфу внутреннего уха . [ 51]
X-сцепленная миопатия с избыточной аутофагией — редкое генетическое заболевание, возникающее в результате мутаций в гене VMA21. [53] Заболевание начинается в детстве и приводит к медленно прогрессирующей мышечной слабости, обычно начинающейся в ногах, и некоторым пациентам в конечном итоге может потребоваться помощь в инвалидной коляске с возрастом. Белок Vma21 помогает в сборке V-АТФазы, а мутации, связанные с XMEA, приводят к снижению активности V-АТФазы и повышению лизосомального pH. [53]
Термин V o имеет строчную букву "o" (а не цифру "ноль") в нижнем индексе. "o" обозначает олигомицин , который связывается с гомологичной областью в F-АТФазе . Стоит отметить, что обозначения человеческих генов в NCBI обозначают его как "ноль", а не букву "o". Например, ген человеческой субъединицы c Vo указан в базе данных генов NCBI как "ATP6V0C" (с нулем), а не "ATP6VOC" (с "o"). Во многих литературных источниках также делают эту ошибку.