Анализ защиты от нуклеазы — это лабораторный метод, используемый в биохимии и генетике для идентификации отдельных молекул РНК в гетерогенном образце РНК, извлеченном из клеток . Метод позволяет идентифицировать одну или несколько молекул РНК с известной последовательностью даже при низкой общей концентрации . Извлеченная РНК сначала смешивается с антисмысловыми РНК или ДНК- зондами, которые комплементарны интересующей последовательности или последовательностям, а комплементарные цепи гибридизуются с образованием двухцепочечной РНК (или гибрида ДНК-РНК). Затем смесь подвергается воздействию рибонуклеаз , которые специфически расщепляют только одноцепочечную РНК, но не обладают активностью против двухцепочечной РНК. Когда реакция завершается, восприимчивые области РНК разрушаются до очень коротких олигомеров или до отдельных нуклеотидов ; выжившие фрагменты РНК — это те, которые были комплементарны добавленной антисмысловой цепи и, таким образом, содержали интересующую последовательность.
Зонды готовятся путем клонирования части интересующего гена в векторе под контролем любого из следующих промоторов: SP6, T7 или T3. Эти промоторы распознаются ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, первоначально охарактеризованными у бактериофагов. Полученные зонды радиоактивны, поскольку они готовятся путем транскрипции in vitro с использованием радиоактивных UTP. Некомплементированная ДНК или РНК расщепляется нуклеазами. Когда зонд представляет собой молекулу ДНК, используется нуклеаза S1 ; когда зонд представляет собой РНК, может использоваться любая одноцепочечная специфическая рибонуклеаза. Таким образом, выживший комплемент зонда-мРНК просто обнаруживается с помощью авторадиографии.
Анализы защиты от нуклеазы используются для картирования интронов и 5' и 3' концов транскрибированных участков генов . Количественные результаты могут быть получены относительно количества целевой РНК, присутствующей в исходном клеточном экстракте - если мишень является информационной РНК , это может указывать на уровень транскрипции гена в клетке.
Они также используются для обнаружения присутствия двухцепочечной РНК, присутствие которой может означать РНК-интерференцию .
Нозерн-блоттинг — это лабораторная техника, которая дает похожую информацию. Она медленнее и менее количественная, но также дает точную информацию о размере целевой РНК. Продукты анализа защиты от нуклеазы ограничены размером исходных зондов из-за разрушения негибридизованной РНК на этапе расщепления нуклеазой.