Анализ транскрипции стока — это анализ в молекулярной биологии , который проводится in vitro для определения положения сайта начала транскрипции (1 пара оснований выше) конкретного промотора, а также его точности и скорости транскрипции in vitro . [1] [2] [3]
Сток-транскрипцию можно использовать для количественного измерения влияния изменения областей промотора на уровни транскрипции in vitro, [1] [2] [4] Однако из-за своей природы in vitro этот анализ не может точно предсказать транскрипцию клеточно-специфического гена. скорости, в отличие от анализов in vivo, таких как ядерный анализ. [1] [2]
Для проведения анализа транскрипции интересующий ген, включая промотор , клонируют в плазмиду . [4] Плазмиду расщепляют по известному сайту разреза рестриктазой, расположенному ниже сайта начала транскрипции, так что ожидаемый продукт оттока мРНК можно было бы легко отделить с помощью гель-электрофореза . [1] [2] [4] Перед проведением этого анализа ДНК должна быть тщательно очищена. [1] [2] Для инициации транскрипции к линеаризованной ДНК добавляются радиоактивно меченные UTP , другие нуклеотиды и РНК-полимераза . [1] [2] Транскрипция продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не достигнет конца ДНК, где она просто «съезжает» с матрицы ДНК, в результате чего образуется фрагмент мРНК определенной длины. [1] [2] Затем этот фрагмент можно разделить с помощью гель-электрофореза вместе со стандартами размера и подвергнуть авторадиографии. [1] [2] [4] Соответствующий размер полосы будет соответствовать размеру мРНК от сайта разреза рестриктазой до сайта начала транскрипции (+1). [4] Интенсивность полосы будет указывать на количество произведенной мРНК. [4]
Кроме того, его можно использовать для определения того, осуществляется ли транскрипция в определенных условиях (т.е. в присутствии различных химических веществ). [5]