stringtranslate.com

Кап-анализ экспрессии генов

Cap-анализ экспрессии генов ( CAGE ) — это метод экспрессии генов , используемый в молекулярной биологии для получения моментального снимка 5'-конца популяции информационной РНК в биологическом образце ( транскриптоме ). Небольшие фрагменты (исторически длиной 27 нуклеотидов , но теперь ограниченные только технологиями секвенирования) из самых начал мРНК (5'-концы кэпированных транскриптов) извлекаются, подвергаются обратной транскрипции в кДНК, амплифицируются с помощью ПЦР (при необходимости) и секвенируются . CAGE был впервые опубликован Хаяшизаки, Карнинчи и соавторами в 2003 году. [1] CAGE широко использовался в исследовательских проектах FANTOM .

Анализ

Выход CAGE представляет собой набор коротких нуклеотидных последовательностей (часто называемых тегами по аналогии с экспрессированными тегами последовательностей ) с их наблюдаемыми числами. Число копий тегов CAGE обеспечивает цифровую количественную оценку распространенности транскриптов РНК в биологических образцах. Используя референтный геном, исследователь обычно может с некоторой уверенностью определить исходную мРНК (и, следовательно, из какого гена ) была извлечена метка.

В отличие от аналогичной техники последовательного анализа экспрессии генов (SAGE), в которой метки берутся из других частей транскриптов, CAGE в первую очередь используется для определения точных мест начала транскрипции в геноме. Эти знания, в свою очередь, позволяют исследователю исследовать структуру промотора, необходимую для экспрессии генов.

Теги CAGE, как правило, начинаются с дополнительного гуанина (G), который не кодируется в геноме, что приписывается 5′-расширению без шаблона во время синтеза первой цепи ДНК [2] или обратной транскрипции самого колпачка. [3] Если это не исправить, это может вызвать ошибочное картирование тегов CAGE, например, на нетранскрибированные псевдогены. [2] С другой стороны, это добавление G также использовалось в качестве сигнала для фильтрации более надежных пиков TSS. [4]

История

Первоначальный метод CAGE (Shiraki et al. , 2003) [1] использовал CAP Trapper [5] для захвата 5'-концов, олиго-dT-праймеры для синтеза кДНК, рестрикционный фермент типа IIs MmeI для расщепления тегов и метод Сэнгера для их секвенирования.

Случайные праймеры обратной транскрипции были введены в 2006 году Кодзиусом и соавторами [6] для лучшего обнаружения неполиаденилированных РНК.

В DeepCAGE (Вален и др. , 2008) [7] конкатемеры тегов были секвенированы с более высокой производительностью на платформе секвенирования « следующего поколения » 454 .

В 2008 году в протокол DeepCAGE было добавлено мультиплексирование штрихкодов (Maeda et al. , 2008). [8]

В nanoCAGE (Plessy et al. , 2010) [9] 5'-концы или РНК захватывались методом переключения шаблонов вместо CAP Trapper, чтобы анализировать меньшие начальные количества общей РНК. Более длинные теги расщеплялись ферментом рестрикции типа III EcoP15I и напрямую секвенировались на платформе Solexa (затем Illumina) без конкатенации.

Методология CAGEscan (Plessy et al. , 2010) [9] , в которой пропускается ферментативное расщепление метки, а 5'-кДНК секвенируются по парным концам , была представлена ​​в той же статье для связи новых промоторов с известными аннотациями.

С HeliScopeCAGE (Kanamori-Katayama et al. , 2011) [10] протокол CAGE с ловушкой CAP был изменен, чтобы пропустить ферментативное расщепление метки и секвенировать непосредственно кэпированные 5′ концы на платформе HeliScope, без ПЦР-амплификации. Затем он был автоматизирован Itoh et al. [11] в 2012 году.

В 2012 году Такахаши и др. [12] обновили стандартный протокол CAGE для расщепления меток с помощью EcoP15I и их секвенирования на платформе Illumina-Solexa.

В 2013 году Батут и др. [13] объединили улавливатель CAP, переключение шаблонов и расщепление 5′-фосфат-зависимой экзонуклеазой в RAMPAGE для максимизации специфичности промотора.

В 2014 году Мурата и др. [14] опубликовали протокол nAnTi-CAGE , в котором кэпированные 5'-концы секвенируются на платформе Illumina без ПЦР-амплификации и расщепления меток.

В 2017 году Пулен и др. [15] обновили протокол nanoCAGE , чтобы использовать метод тегирования (основанный на транспозиции Tn5 ) для мультиплексирования.

В 2018 году Цветесич и др. [16] повысили чувствительность CAGE, захваченного CAP, путем введения селективно расщепляемой РНК-носителя (SLIC-CAGE, «Super-Low Input Carrier-CAGE»).

В 2021 году Такахаши и др. [17] упростили секвенирование библиотек CAGE на секвенаторах Illumina, пропустив синтез второй цепи и напрямую загрузив одноцепочечные кДНК (Low Quantity Single Strand CAGE, «LQ-ssCAGE»).

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab Шираки, Т; Кондо, С; Катаяма, С; и др. (2003-12-23). ​​"Анализ экспрессии генов кэпа для высокопроизводительного анализа начальной точки транскрипции и идентификации использования промотора". Proc Natl Acad Sci USA . 100 (26): 15776–81. Bibcode : 2003PNAS..10015776S. doi : 10.1073/pnas.2136655100 . PMC  307644. PMID  14663149 .
  2. ^ ab Zhao, Xiaobei (2011). "Систематическая кластеризация ландшафтов мест начала транскрипции". PLOS ONE . 6 (8): e23409. Bibcode : 2011PLoSO...623409Z. doi : 10.1371/journal.pone.0023409 . PMC 3160847. PMID  21887249 . 
  3. ^ Отаке, Хидеки; Окото, Куниё; Ишимару, Ёсихиро; Като, Сейши (2004). «Определение последовательности кэпированного сайта мРНК на основе обнаружения кэп-зависимого добавления нуклеотидов с использованием метода якорной лигации». DNA Res . 11 (4): 305–9. doi : 10.1093/dnares/11.4.305 . PMID  15500255.
  4. ^ Камби, Джейсон (2015). «NanoCAGE-XL и CapFilter: подход к идентификации высоконадежных стартовых участков транскрипции по всему геному». BMC Genomics . 16 (1): 597. doi : 10.1186/s12864-015-1670-6 . PMC 4534009 . PMID  26268438. 
  5. ^ Карнинчи, Пьеро (1996). «Высокоэффективное клонирование полноразмерной кДНК с помощью биотинилированного ловушки CAP». Геномика . 37 (3): 327–36. doi :10.1006/geno.1996.0567. PMID  8938445.
  6. ^ Кодзиус, Римантас (2006). «CAGE: анализ экспрессии генов с помощью кэпа». Nat Methods . 3 (3): 211–22. doi :10.1038/nmeth0306-211. PMID  16489339. S2CID  32641130.
  7. ^ Вален, Эйвинд (2009). «Обнаружение и анализ основных промоторов гиппокампа по всему геному с использованием DeepCAGE». Genome Res . 19 (2): 255–265. doi :10.1101/gr.084541.108. PMC 2652207. PMID  19074369 . 
  8. ^ Маэда, Норихиро (2008). «Разработка метода маркировки ДНК-штрихкодом для мониторинга динамических изменений экспрессии генов с использованием сверхвысокопроизводительного секвенатора». BioTechniques . 45 (1): 95–7. doi : 10.2144/000112814 . PMID  18611171 . Получено 28.04.2016 .
  9. ^ ab Plessy, Charles (2010). «Связывание промоторов с функциональными транскриптами в небольших образцах с помощью nanoCAGE и CAGEscan». Nat Methods . 7 (7): 528–34. doi :10.1038/nmeth.1470. PMC 2906222. PMID  20543846 . 
  10. ^ Канамори-Катаяма, Муцуми (2011). «Неамплифицированный кэп-анализ экспрессии генов на секвенаторе одной молекулы». Геном Рез . 21 (7): 1150–9. дои : 10.1101/гр.115469.110. ПМК 3129257 . ПМИД  21596820. 
  11. ^ Itoh, Masayoshi (2012). "Автоматизированный рабочий процесс для подготовки кДНК для анализа кэпа экспрессии генов на секвенаторе одной молекулы". PLOS ONE . 7 (1): e30809. Bibcode : 2012PLoSO...730809I. doi : 10.1371 /journal.pone.0030809 . PMC 3268765. PMID  22303458. 
  12. ^ Такахаши, Хазуки (2012). «Профилирование экспрессии, центрированной на 5' конце, с использованием экспрессии генов с помощью анализа кэпа и секвенирования следующего поколения». Nat Protoc . 7 (3): 542–61. doi :10.1038/nprot.2012.005. PMC 4094379. PMID 22362160  . 
  13. ^ Батут, Филипп (2013). «Высокоточное профилирование промотора выявляет широкое использование альтернативных промоторов и экспрессию генов развития, управляемую транспозоном». Genome Res . 23 (1): 169–80. doi :10.1101/gr.139618.112. PMC 3530677. PMID 22936248  . 
  14. ^ Мурата, Мицуёси (2014). «Обнаружение экспрессированных генов с помощью CAGE». Сети регуляции факторов транскрипции . Методы в молекулярной биологии. Том 1164. С. 67–85. doi :10.1007/978-1-4939-0805-9_7. ISBN 978-1-4939-0804-2. PMID  24927836.
  15. ^ Пулен, Стефан (2017). «NanoCAGE: Метод анализа кодирующих и некодирующих 5′-кэпированных транскриптомов». Промотор-ассоциированная РНК . Методы в молекулярной биологии. Т. 1543. С. 57–109. doi :10.1007/978-1-4939-6716-2_4. ISBN 978-1-4939-6714-8. PMID  28349422.
  16. ^ Цветесич, Невена (2018). «SLIC-CAGE: картирование сайта начала транскрипции высокого разрешения с использованием нанограммовых уровней общей РНК». Genome Research . 28 (12): 1943–1956. doi :10.1101/gr.235937.118. PMC 6280763. PMID  30404778 . 
  17. ^ Такахаши, Хазуки (2021). «Low Quantity Single Strand CAGE (LQ-ssCAGE) Maps Regulatory Enhancers and Promoters». Enhancers and Promoters . Methods Mol Biol. Vol. 2351. pp. 67–90. doi :10.1007/978-1-0716-1597-3_4. ISBN 978-1-0716-1596-6. PMID  34382184. S2CID  243553132.

Внешние ссылки