Анализ C 0 t , метод, основанный на принципах кинетики реассоциации ДНК , представляет собой биохимический метод, который измеряет количество повторяющейся ДНК в образце ДНК, таком как геном . [1] Он используется для изучения структуры и организации генома , а также используется для упрощения секвенирования геномов, содержащих большое количество повторяющихся последовательностей. [2]
Процедура включает нагревание образца геномной ДНК до тех пор, пока он не денатурирует в одноцепочечную форму, а затем медленное охлаждение, чтобы цепи могли снова спариться. Пока образец остывает, проводятся измерения того, какая часть ДНК спарена при каждой температуре.
Количество одно- и двухцепочечной ДНК измеряется путем быстрого разбавления образца, что замедляет реассоциацию, а затем связывания ДНК с колонкой гидроксиапатита . Колонка сначала промывается буфером фосфата натрия низкой концентрации , который элюирует одноцепочечную ДНК, а затем фосфатом высокой концентрации, который элюирует двухцепочечную ДНК. Количество ДНК в этих двух растворах затем измеряется с помощью спектрофотометра .
Поскольку последовательность одноцепочечной ДНК должна найти свою комплементарную нить для реформирования двойной спирали, распространенные последовательности ренатурируют быстрее, чем редкие. Действительно, скорость, с которой последовательность будет реассоциироваться, пропорциональна количеству копий этой последовательности в образце ДНК. Образец с высокоповторяющейся последовательностью будет ренатурировать быстро, в то время как сложные последовательности будут ренатурировать медленно.
Однако вместо простого измерения процента двухцепочечной ДНК в зависимости от времени, измеряется количество ренатурации относительно значения C 0 t. Значение C 0 t является произведением C 0 (начальной концентрации ДНК), t (времени в секундах) и константы, которая зависит от концентрации катионов в буфере. Повторяющаяся ДНК будет ренатурировать при низких значениях C 0 t, в то время как сложные и уникальные последовательности ДНК будут ренатурировать при высоких значениях C 0 t. Быстрая ренатурация повторяющейся ДНК обусловлена наличием многочисленных комплементарных последовательностей.
Фильтрация C 0 t — это метод, который использует принципы кинетики ренатурации ДНК для отделения повторяющихся последовательностей ДНК , которые доминируют во многих эукариотических геномах , от «богатых генами» одиночных/низкокопийных последовательностей. [2] Это позволяет секвенированию ДНК сосредоточиться на наиболее информативных и интересных частях генома, что ускорит открытие новых генов и сделает процесс более эффективным. [3] [4]
Впервые он был разработан и использован Роем Бриттеном и его коллегами в Институте Карнеги в Вашингтоне в 1960-х годах. [5] [6] Особо следует отметить, что именно с помощью анализа C 0 t была впервые обнаружена избыточная (повторяющаяся) природа эукариотических геномов. [7] Однако только после прорывных экспериментов по кинетике реассоциации ДНК Бриттена и его коллег было показано, что не вся ДНК кодирует гены. Фактически, их эксперименты продемонстрировали, что большая часть эукариотической геномной ДНК состоит из повторяющихся, некодирующих элементов. [1]