Бактериальная одногибридная (B1H) система представляет собой метод идентификации специфического для последовательности целевого сайта ДНК-связывающего домена . В этой системе заданный фактор транскрипции (TF) экспрессируется в виде слияния с субъединицей РНК-полимеразы . Параллельно библиотека рандомизированных олигонуклеотидов, представляющих потенциальные целевые последовательности TF, клонируется в отдельный вектор, содержащий селектируемые гены HIS3 и URA3 . Если ДНК-связывающий домен (приманка) связывается с потенциальным целевым сайтом ДНК (добычей) in vivo , он будет привлекать РНК-полимеразу к промотору и активировать транскрипцию репортерных генов в этом клоне. Два репортерных гена, HIS3 и URA3, допускают положительный и отрицательный отбор соответственно. В конце процесса положительные клоны секвенируются и исследуются с помощью инструментов поиска мотивов для определения предпочтительной целевой последовательности ДНК. [1]
Во всех живых организмах регуляция экспрессии генов контролируется взаимодействиями между ДНК-связывающими регуляторными белками (факторами транскрипции) и цис-регуляторными элементами , последовательностями ДНК в генах или вокруг них, которые действуют как целевые сайты для ДНК-связывающих белков. Связываясь с цис-регуляторными последовательностями и друг с другом, факторы транскрипции тонко настраивают уровни транскрипции, стабилизируя/дестабилизируя связывание РНК-полимеразы с промотором гена. Но, несмотря на их важность и повсеместность, мало что известно о том, где именно связывается каждый из этих регуляторных белков. Литература предполагает, что почти 8% человеческих генов кодируют факторы транскрипции, а функции и особенности их взаимодействий остаются в значительной степени неизученными. [2] Мы находимся на грани конвергенции высокопроизводительных технологий и геномной теории, которая позволяет исследователям начать картирование этих взаимодействий в масштабе всего генома. Только недавно была предпринята попытка полного обзора особенностей связывания ДНК для большого семейства доменов связывания ДНК. B1H — это всего лишь один из многих новых методов, полезных для изучения взаимодействия белков и ДНК. [3]
Требуется трансформация бактериального хозяина двумя различными плазмидами . Одна предназначена для экспрессии интересующего ДНК-связывающего белка в виде конструкции слияния с субъединицей РНК-полимеразы (приманки). Другая плазмида содержит область рандомизированной последовательности, представляющую потенциальные сайты связывания (добычу), которая, если связана с химерным продуктом слияния, управляет экспрессией нижестоящих репортерных генов. Эта репортерная область облегчает как положительный, так и отрицательный отбор HIS3 и URA3 соответственно, что вместе позволяет изолировать добычу, содержащую истинную целевую последовательность ДНК. HIS3 и URA3 кодируют белки, необходимые для биосинтеза гистидина и урацила.
Использование отрицательного селективного маркера имеет решающее значение для значительного снижения частоты ложноположительных результатов. Самоактивирующаяся добыча, где рандомизированная область облегчает экспрессию репортера в отсутствие связывания TF, удаляется путем трансформации библиотеки репортерных векторов в бактерии в отсутствие приманки и анализа роста на чашках, содержащих 5-фтор-оротовую кислоту (5-FOA). Белковый продукт URA3 превращает 5-FOA в токсичное соединение, тем самым позволяя выживать только тем колониям, которые содержат репортерные векторы, которые не являются самоактивирующимися. Отрицательный отбор обычно предшествует положительному отбору, так что меньшая очищенная библиотека добычи может быть подвергнута более строгому процессу положительного отбора. После трансформации очищенной библиотеки добычи плазмидой-приманкой положительный отбор достигается путем выращивания хозяина E. coli на минимальной среде, не содержащей гистидина (селективная среда NM), которая обычно дополняется различными концентрациями 3-амино-триазола (3-AT), конкурентного ингибитора HIS3. HIS3 кодирует белок, необходимый для биосинтеза гистидина, и, таким образом, только те клетки, которые содержат комбинации приманка-жертва, которые активируют репортерные гены, смогут расти. Манипулирование концентрациями 3-AT позволяет характеризовать жесткость связывания. Таким образом, исследователи могут оценить, насколько сильно приманка связывает свою добычу (что коррелирует с уровнем экспрессии HIS3) и, таким образом, определить, какие сайты связывания нуклеотидов имеют сильные или слабые предпочтения для данного основания. Другими словами, если клетки могут расти, несмотря на высокую концентрацию 3-AT, связывание приманка-жертва должно быть достаточно жестким, чтобы управлять экспрессией репортерного гена (HIS3) на достаточном уровне для преодоления возникающего конкурентного ингибирования. Наконец, положительные клоны секвенируются и исследуются с помощью уже существующих инструментов поиска мотивов (например, MEME, BioProspector). [3]
Система одногибридных бактерий претерпела многочисленные изменения с момента своего создания в 2005 году. [3] В конечном итоге она возникла как вариация системы двухгибридных бактерий, задуманной в 2000 году, которая сама была вдохновлена одно- и двухгибридными системами дрожжей. [4] В то время как двухгибридные версии могут оценивать как взаимодействие белок-белок , так и взаимодействие белок-ДНК, одногибридная система специализируется на последнем. Система B1H Менга и др. отличается от двухгибридной версии в двух ключевых отношениях. Она использует рандомизированную библиотеку жертв, состоящую из множества (<2x10 8 ) уникальных потенциальных целевых последовательностей, а также добавляет этап отрицательного отбора для очистки этой библиотеки от самоактивирующихся клонов. [1] [3] Хотя эти идеи были заимствованы из оригинальной дрожжевой одногибридной системы, [5] они еще не применялись к бактериальному хозяину до 2005 года. По мере роста популярности метода исследователи вносили поправки в свои протоколы для улучшения системы B1H. Разработка конструкции слияния (приманки) к омега-, а не альфа-субъединице РНК-полимеразы в последнее время была одобрена для улучшения стереохимии и динамического диапазона химеры. [6] Домен цинкового пальца на конструкции слияния и соответствующий ему целевой участок ДНК, прилегающий к рандомизированной последовательности добычи, также был добавлен для повышения сродства и специфичности взаимодействий белок-ДНК. Это повышенное общее сродство связывания позволяет характеризовать даже те белки домена связывания ДНК, которые слабо взаимодействуют с целевой последовательностью. [7]
.
Система B1H имеет значительные преимущества по сравнению с другими методами, исследующими взаимодействия белок-ДНК. Считывание иммунопреципитации хроматина на основе микрочипов ( ChIP-chip ) для высокопроизводительного определения мест связывания основано на специфических антителах, которые не всегда могут быть доступны. Методы, основанные на связывающих белок микрочипах, также требуют дополнительных этапов очистки белка, которые не требуются в системе B1H. Кроме того, эти основанные на микрочипах методы часто являются непомерными с точки зрения необходимости специальных помещений и опыта для анализа полученных данных. SELEX , другая система, обычно используемая для идентификации целевых нуклеиновых кислот для ДНК-связывающих белков, требует нескольких раундов отбора. Напротив, бактериальная одногибридная система требует всего одного раунда отбора in vitro и также предлагает низкотехнологичную альтернативу технологиям на основе микрочипов. Антитела не требуются для изучения взаимодействий ДНК-связывающих белков в системе B1H. Еще одним преимуществом является то, что система B1H работает не только с мономерными белками, но и с белками, которые связывают ДНК в виде комплексов. Система B1H должна рассматриваться как специализированная техника для изучения ДНК-белковых взаимодействий, тогда как двухгибридные вариации (B2H и Y2H ) могут оценивать как белок-белковые, так и белок-ДНК взаимодействия. Эти двухгибридные системы являются многоцелевыми, но ограничены в плане анализа только одной библиотеки «добычи». Преимущество бактериальной одногибридной системы над дрожжевой одногибридной системой (Y1H) заключается в более высокой эффективности трансформации плазмид в бактерии, что позволяет исследовать более сложные библиотеки «добычи». [1] [3]
Несмотря на вышеупомянутые преимущества в качестве специализированного инструмента, система B1H имеет некоторые недостатки. Во-первых, система отбора B1H ограничена в своей способности определять специфичность связывания факторов транскрипции с длинными сайтами связывания. Это возникает из-за того, что количество рандомизированных клонов «добычи», необходимых для представления всех возможных целевых последовательностей, увеличивается экспоненциально с количеством нуклеотидов в этой целевой последовательности. Во-вторых, некоторые эукариотические факторы могут не экспрессироваться или не сворачиваться эффективно в бактериальной системе, что объясняется различными регуляторными сетями и транскрипционными механизмами. Следовательно, при работе с ДНК-связывающими белками эукариотического происхождения гибридная система на основе дрожжей может быть полезной. В-третьих, система B1H может не идеально подходить для факторов транскрипции, которые распознают сайты связывания с низким сродством. Логика здесь заключается в том, что конкуренция, создаваемая сайтами связывания в других местах бактериального генома, может ограничивать сигнал, который может быть реализован с одного сайта связывания, который присутствует выше репортера. [1] [3]
Система B1H предоставляет инструмент в нашем арсенале для идентификации ДНК-связывающих специфичностей факторов транскрипции и, таким образом, для прогнозирования их целевых генов и регуляторных элементов геномной ДНК. Она также позволяет исследовать эффекты белок-белковых взаимодействий на связывание ДНК, что может в дальнейшем направлять прогнозирование цис-регуляторных модулей на основе кластеризации сайтов связывания. Более того, система выбора B1H имеет значение для прогнозирования регуляторных ролей ранее не охарактеризованных факторов транскрипции. [1]
Используя бактериальную одногибридную систему, одно исследование охарактеризовало 35 членов сегментационной сети Drosophila melanogaster, которая включает в себя репрезентативных членов всех основных классов белков домена связывания ДНК. [8] Последствия для медицинских исследований очевидны из другого исследования, в котором использовалась система B1H для определения специфичности связывания ДНК транскрипционного регулятора для гена в Mycobacterium tuberculosis . [9] Система B1H также использовалась для определения важного элемента оборота в Escherichia coli. [10]
