Бактериальная целлюлоза — это органическое соединение с формулой ( C
6ЧАС
10О
5)
нпроизводится определенными типами бактерий . Хотя целлюлоза является основным структурным материалом большинства растений, она также производится бактериями, в основном из родов Komagataeibacter , Acetobacter , Sarcina ventriculi и Agrobacterium . Бактериальная или микробная целлюлоза имеет свойства, отличные от растительной целлюлозы, и характеризуется высокой чистотой, прочностью, формуемостью и повышенной способностью удерживать воду. [1] В естественной среде обитания большинство бактерий синтезируют внеклеточные полисахариды , такие как целлюлоза, которые образуют защитные оболочки вокруг клеток. Хотя бактериальная целлюлоза производится в природе, в настоящее время изучаются многие методы для усиления роста целлюлозы из культур в лабораториях как крупномасштабный процесс. Управляя методами синтеза, полученная микробная целлюлоза может быть адаптирована для получения определенных желаемых свойств. Например, внимание было уделено бактериям Komagataeibacter xylinus из-за уникальных механических свойств ее целлюлозы и применения в биотехнологии , микробиологии и материаловедении .
Исторически бактериальная целлюлоза ограничивалась производством желеобразных десертов nata de piña и nata de coco , филиппинского пищевого продукта. [2] [3] [4] Благодаря достижениям в области синтеза и характеристики бактериальной целлюлозы, материал используется для широкого спектра коммерческих приложений, включая текстиль, косметику и продукты питания, а также медицинские приложения. Было выдано много патентов на применение микробной целлюлозы, и несколько активных областей исследований пытаются лучше охарактеризовать микробную целлюлозу и использовать ее в новых областях. [1]
Как материал, целлюлоза была впервые открыта в 1838 году Ансельмом Пайеном. Пайен смог выделить целлюлозу из других растительных веществ и химически охарактеризовать ее. В одном из своих первых и наиболее распространенных промышленных применений целлюлоза из древесной массы использовалась для производства бумаги. Она идеально подходит для отображения информации в печатной форме благодаря своей высокой отражательной способности, высокой контрастности, низкой стоимости и гибкости. Открытие целлюлозы, производимой бактериями, в частности, Acetobacter xylinum , было присуждено А. Дж. Брауну в 1886 году с синтезом внеклеточного студенистого мата. [5] Однако только в 20 веке были проведены более интенсивные исследования бактериальной целлюлозы. Спустя несколько десятилетий после первоначального открытия микробной целлюлозы К. А. Браун изучил целлюлозный материал, полученный путем ферментации сока сахарного тростника Луизианы, и подтвердил результаты А. Дж. Брауна. [6] Другие исследователи сообщили о формировании целлюлозы другими различными организмами, такими как Acetobacter pasteurianum , Acetobacter rancens , Sarcina ventriculi и Bacterium xylinoides . В 1931 году Тарр и Хибберт опубликовали первое подробное исследование формирования бактериальной целлюлозы, проведя серию экспериментов по выращиванию A. xylinum на питательных средах. [7]
В середине 1900-х годов Хестрин и др. доказали необходимость глюкозы и кислорода в синтезе бактериальной целлюлозы. Вскоре после этого Колвин обнаружил синтез целлюлозы в образцах, содержащих бесклеточный экстракт A. xylinum , глюкозу и АТФ. [8] В 1949 году микрофибриллярная структура бактериальной целлюлозы была охарактеризована Мюлеталером. [9] Дальнейшие исследования бактериальной целлюлозы привели к новым способам использования и применения этого материала.
Бактерии, которые производят целлюлозу, включают виды грамотрицательных бактерий, такие как Acetobacter , Azotobacter , Rhizobium , Pseudomonas , Salmonella , Alcaligenes , и виды грамположительных бактерий , такие как Sarcina ventriculi . [10] Наиболее эффективными производителями целлюлозы являются A. xylinum , A. hansenii и A. pasteurianus . Из них A. xylinum является модельным микроорганизмом для фундаментальных и прикладных исследований целлюлозы из-за его способности производить относительно высокие уровни полимера из широкого спектра источников углерода и азота. [11]
Синтез бактериальной целлюлозы — многоступенчатый процесс, включающий два основных механизма: синтез уридиндифосфоглюкозы (UDPGIc) с последующей полимеризацией глюкозы в длинные и неразветвленные цепи (цепь β-1→4 глюкана) целлюлозосинтазой . Специфика синтеза целлюлозы подробно описана. [12] [13] Первый механизм хорошо известен, в то время как второй все еще нуждается в изучении. Производство UDPGIc начинается с углеродных соединений (таких как гексозы , глицерин , дигидроксиацетон , пируват и дикарбоновые кислоты ), входящих в цикл Кребса , глюконеогенез или пентозофосфатный цикл в зависимости от того, какой источник углерода доступен. Затем он проходит через фосфорилирование вместе с катализом, за которым следует изомеризация промежуточного продукта и процесс, известный как UDPGIc пирофосфорилаза, для преобразования соединений в UDPGIc, предшественник производства целлюлозы. Было высказано предположение, что полимеризация глюкозы в β-1→4 глюкановую цепь либо включает липидный промежуточный продукт [14] , либо не включает липидный промежуточный продукт [12], хотя структурные энзимологические исследования и эксперименты in vitro показывают, что полимеризация может происходить путем прямого ферментативного переноса глюкозильного фрагмента из нуклеотидного сахара в растущий полисахарид. [15] A. xylinum обычно преобразует углеродные соединения в целлюлозу с эффективностью около 50%. [14]
Производство целлюлозы в значительной степени зависит от нескольких факторов, таких как среда роста , условия окружающей среды и образование побочных продуктов. Среда ферментации содержит углерод , азот и другие макро- и микроэлементы, необходимые для роста бактерий. Бактерии наиболее эффективны, когда им предоставляется обильный источник углерода и минимальный источник азота. [16] Глюкоза и сахароза являются наиболее часто используемыми источниками углерода для производства целлюлозы, в то время как фруктоза , мальтоза , ксилоза , крахмал и глицерин были опробованы. [17] Иногда для увеличения производства целлюлозы может использоваться этанол . [18] Проблема с использованием глюкозы заключается в том, что глюконовая кислота образуется как побочный продукт, который снижает pH культуры и, в свою очередь, снижает производство целлюлозы. Исследования показали, что производство глюконовой кислоты может быть уменьшено в присутствии лигносульфоната . [19] Добавление органических кислот, в частности уксусной кислоты , также помогло в более высоком выходе целлюлозы. [20] Исследования по использованию среды патоки в ферментере [21], а также добавленных компонентов патоки сахарного тростника [22] на определенных штаммах бактерий были изучены, и результаты показали увеличение производства целлюлозы.
Добавление дополнительного азота обычно снижает производство целлюлозы, в то время как добавление молекул-предшественников, таких как аминокислоты [23] и метионин, улучшает выход. Пиридоксин , никотиновая кислота , п-аминобензойная кислота и биотин являются витаминами, важными для производства целлюлозы, тогда как пантотенат и рибофлавин оказывают противоположное действие. [24] В реакторах, где процесс более сложный, добавляются водорастворимые полисахариды, такие как агар [25] , ацетан и альгинат натрия [26] , чтобы предотвратить комкование или коагуляцию бактериальной целлюлозы.
Другими основными факторами окружающей среды, влияющими на производство целлюлозы, являются pH, температура и растворенный кислород. Согласно экспериментальным исследованиям, оптимальная температура для максимального производства составляет от 28 до 30 °C. [27] Для большинства видов оптимальный pH составляет от 4,0 до 6,0. [17] Контроль pH особенно важен в статических культурах, поскольку накопление глюконовой, уксусной или молочной кислоты снижает pH намного ниже оптимального диапазона. Содержание растворенного кислорода можно изменять с помощью скорости мешалки, поскольку это необходимо для статических культур, где субстраты необходимо транспортировать путем диффузии. [28]
Статические и перемешиваемые культуры являются обычными способами производства бактериальной целлюлозы. Как статические, так и перемешиваемые культуры нецелесообразны для крупномасштабного производства, поскольку статические культуры имеют длительный период культивирования, а также интенсивную рабочую силу, а перемешиваемые культуры производят целлюлозоотрицательные мутанты наряду с их реакциями из-за быстрого роста. [29] Таким образом, реакторы предназначены для сокращения времени культивирования и подавления превращения штаммов, продуцирующих бактериальную целлюлозу, в целлюлозоотрицательные мутанты. Обычными используемыми реакторами являются вращающийся дисковый реактор, [30] роторный биопленочный контактор (RBC), [29] биореактор , оснащенный спин-фильтром, [31] и реактор с силиконовой мембраной. [32]
Как наиболее распространенный органический материал на Земле , целлюлозу можно разделить на растительную целлюлозу и бактериальную целлюлозу, обе из которых встречаются в природе. Растительная целлюлоза, из которой состоят клеточные стенки большинства растений, представляет собой жесткую сетчатую структуру, в которой целлюлозные фибриллы являются основными архитектурными элементами. Хотя бактериальная целлюлоза имеет ту же молекулярную формулу, что и растительная целлюлоза, она имеет существенно отличающиеся макромолекулярные свойства и характеристики. [8] В целом, микробная целлюлоза более химически чиста, не содержит гемицеллюлозы или лигнина , имеет более высокую водоудерживающую способность и гидрофильность , большую прочность на разрыв в результате большего количества полимеризации , сверхтонкую сетевую архитектуру. Кроме того, бактериальная целлюлоза может быть произведена на различных субстратах и может быть выращена практически в любой форме из-за высокой формуемости во время формирования. [33] Кроме того, бактериальная целлюлоза имеет более кристаллическую структуру по сравнению с растительной целлюлозой и образует характерные лентовидные микрофибриллы . [1] Эти тонкие микрофибриллы , являющиеся отличительной чертой микробной целлюлозы, значительно меньше, чем в растительной целлюлозе, что делает бактериальную целлюлозу гораздо более пористой. [9]
Целлюлоза состоит из углерода , кислорода и водорода и классифицируется как полисахарид , что указывает на то, что это углевод , который проявляет полимерные характеристики. Целлюлоза состоит из полимеров с прямой цепью, чьи базовые единицы глюкозы удерживаются вместе бета-связями. Структурную роль целлюлозы в клеточных стенках сравнивают с ролью стеклянных нитей стекловолокна или опорных стержней в железобетоне. [ необходима цитата ] Фибриллы целлюлозы крайне нерастворимы и неэластичны и из-за своей молекулярной конфигурации имеют прочность на разрыв, сравнимую со сталью. [ необходима цитата ] Следовательно, целлюлоза придает тканям, в которых она находится, уникальное сочетание химической устойчивости и механической поддержки и гибкости. [34] Бактериальная целлюлоза, вырабатываемая видами Acetobacter , демонстрирует уникальные свойства, включая высокую механическую прочность, высокую водопоглощающую способность, высокую кристалличность и сверхтонкую и высокочистую структуру волокнистой сети. [35] Одной из важнейших особенностей бактериальной целлюлозы является ее химическая чистота. В дополнение к этому, бактериальная целлюлоза устойчива к химикатам и высоким температурам. [36] Было высказано предположение, что бактериальная целлюлоза имеет конструкцию, похожую на «клетку», которая защищает клетку от посторонних материалов и ионов тяжелых металлов, при этом все еще позволяя питательным веществам легко поступать путем диффузии . [2] [37] Бактериальная целлюлоза была описана Луи Пастером как «своего рода влажная кожа, набухшая, студенистая и скользкая». Хотя твердая часть в геле составляет менее одного процента, это почти чистая целлюлоза, не содержащая лигнина и других посторонних веществ. [2] Хотя бактериальная целлюлоза получается в виде сильно набухшего геля, текстура ее совершенно уникальна и отличается от типичных гелей. Целлюлоза имеет сильно набухшую сеть волокон, возникающую из-за наличия пористых структур и туннелей внутри влажной пленки . Растительная целлюлоза имеет водоудерживающую способность 60%, тогда как бактериальная целлюлоза имеет водоудерживающую способность 1000%. [33] Образование целлюлозной пленки происходит на верхней поверхности супернатантной пленки . Большая площадь поверхности важна для хорошей производительности. Образование целлюлозы происходит на границе воздух/целлюлозная пленка, а не на границе среда/целлюлоза. Таким образом, кислород является важным фактором для производства целлюлозы. [1]После периода индукции и быстрого роста толщина неуклонно увеличивается. Фибриллы, по-видимому, не обязательно линейны, но содержат некоторые «точки трехстороннего разветвления» по всей длине. Этот тип разветвления считается связанным с уникальными характеристиками этого материала и происходит из точек разветвления, полученных в результате бинарного деления . [38]
Листовой материал, полученный из бактериальной целлюлозы, обладает замечательными механическими свойствами. По словам Брауна, пленка бактериальной целлюлозы была «очень прочной, особенно если попытаться разорвать ее поперек плоскости роста». [2] Сообщалось, что модуль Юнга для бактериальной целлюлозы достигает 15 ГПа поперек плоскости листа, тогда как самые высокие значения, достигнутые в прошлом полимерными пленками или листами, составляют < 10 ГПа максимум. Высокий модуль Юнга листа был приписан уникальной надмолекулярной структуре, в которой фибриллы биологического происхождения сохраняются и прочно связаны водородными связями . Этот модуль Юнга не меняется ни в зависимости от температуры, ни от используемого процесса культивирования. Очень высокий модуль Юнга этого материала следует приписать его надмолекулярной структуре. [37] [38]
Это свойство возникает из-за смежно выровненных глюкановых цепей, участвующих в меж- и внутрицепочечных водородных связях. [34] Бактериальные субфибриллы целлюлозы кристаллизуются в микрофибриллы, которые группируются, образуя пучки, которые затем образуют «ленты». Эти волокна на два порядка тоньше, чем волокна целлюлозы, получаемые при варке древесины. [8] Сегодня известно, что пленка состоит из случайного скопления фибрилл (шириной < 130 нм), которые состоят из пучка гораздо более тонких микрофибрилл (диаметром от 2 до 4 нм). Также известно, что пленка дает пленку или лист при высыхании, если усадка поперек плоскости ограничена. [38] Сверхтонкие ленты микробной целлюлозы образуют плотную сетчатую структуру, стабилизированную обширными водородными связями. Бактериальная целлюлоза также отличается от своего растительного аналога высоким индексом кристалличности (выше 60%). Две распространенные кристаллические формы целлюлозы, обозначенные как I и II, различаются с помощью рентгеновского , ядерного магнитного резонанса (ЯМР), спектроскопии Рамана и инфракрасного анализа. [8] Бактериальная целлюлоза кристаллографически относится к целлюлозе I, общей с натуральной целлюлозой растительного происхождения, в которой две целлюлозные единицы расположены параллельно в элементарной ячейке . [2] [40] Термин «целлюлоза I» используется для этого параллельного расположения, тогда как кристаллические фибриллы, несущие антипараллельные полиглюкановые цепи, возникают, образуя термодинамически стабильную целлюлозу II. [34] Молекулярное расположение в листе, подтвержденное рентгеновской дифракцией , было таким, что ось молекулярной цепи лежала случайным образом перпендикулярно толщине, так что плоскость (1 1 0) была ориентирована параллельно поверхности. [38]
Хотя целлюлоза образует отчетливую кристаллическую структуру, целлюлозные волокна в природе не являются чисто кристаллическими. В дополнение к кристаллическим и аморфным областям, целлюлозные волокна содержат различные типы неровностей, такие как перегибы или скручивания микрофибрилл, или пустоты, такие как поверхностные микропоры, большие ямки и капилляры . Таким образом, общая площадь поверхности целлюлозного волокна намного больше, чем площадь поверхности идеально гладкого волокна того же размера. Чистый эффект структурной неоднородности внутри волокна заключается в том, что волокна, по крайней мере, частично гидратируются водой при погружении в водную среду, а некоторые микропоры и капилляры достаточно просторны, чтобы обеспечить проникновение. [37]
Сканирующая электронная микроскопия сломанного края выявила кучу очень тонких слоев. Предполагается, что эти фибриллы в слоях связаны посредством межфибриллярных водородных связей, как в целлюлозной бумаге, но плотность межфибриллярных водородных связей должна быть намного выше, так как фибриллы тоньше, следовательно, площадь контакта больше. [38]
Бактериальная целлюлоза имеет широкий спектр текущих и потенциальных будущих применений. Благодаря своим многочисленным уникальным свойствам она используется в пищевой промышленности, медицинской сфере, коммерческих и промышленных продуктах и других технических областях. Бактериальная целлюлоза является универсальным структурным материалом, что позволяет придавать ей различные формы для различных целей. Было выдано несколько патентов на процессы, в которых задействован этот материал. [41] Бактериальные целлюлозные пленки были предложены в качестве временного заменителя кожи в случае человеческих ожогов и других дермальных повреждений. [42]
Самое старое известное применение бактериальной целлюлозы — в качестве сырья для nata de piña , традиционного сладкого десерта из конфет на Филиппинах . Несколько натуральных цветных пигментов (оксикаротиноиды, антоцианы и родственные им антиоксиданты и поглотители свободных радикалов) были включены в кубики бактериальной целлюлозы, чтобы сделать десерт более привлекательным. [43] Бактериальная целлюлоза также использовалась в качестве загустителя для поддержания вязкости в пище и в качестве стабилизирующего агента. Благодаря своей текстуре и содержанию волокон она добавлялась во многие пищевые продукты в качестве диетического волокна . Конкретным примером является Cellulon ®, который является наполнителем, используемым в качестве пищевого ингредиента для действия в качестве загустителя, текстуризатора и/или снижения калорийности. [44] Микробная целлюлоза также использовалась в качестве добавки в диетических напитках в Японии с 1992 года, в частности, в комбуче , ферментированном чайном напитке. [9]
Бактериальная целлюлоза также широко применяется в коммерческих отраслях. В производстве бумаги она используется как сверхпрочная бумага и как сетчатая тонковолокнистая сеть с покрытием, связыванием, загущением и суспендированием. [35] Благодаря своей высокой скорости звука и низким динамическим потерям бактериальная целлюлоза использовалась в качестве акустической или фильтрующей мембраны в высококачественных громкоговорителях и наушниках, продаваемых корпорацией Sony . [2] Бактериальная целлюлоза также используется в качестве добавки в косметической промышленности. Кроме того, она проходит испытания в текстильной промышленности с возможностью производства одежды на основе целлюлозы. [35]
В более современных приложениях микробная целлюлоза стала актуальной в медицинском секторе. Она была испытана и успешно использовалась в качестве перевязочного материала для ран , особенно в случаях ожогов. Исследования показали, что ожоги, обработанные покрытиями из микробной целлюлозы, заживали быстрее, чем при традиционном лечении, и имели меньше рубцов. Местное применение микробной целлюлозы эффективно благодаря способности целлюлозы удерживать воду и проницаемости водяного пара. Высокая способность удерживать воду обеспечивает влажную атмосферу в месте повреждения, что имеет решающее значение для заживления, в то время как способность впитывать влагу позволяет удалять просачивание из раны с места. Кроме того, микробная целлюлоза очень хорошо формуется на поверхности кожи , обеспечивая конформное покрытие даже в обычно сложных для перевязки местах ран, таких как области на лице. Эта технология оказалась настолько успешной, что были разработаны коммерческие продукты из микробной целлюлозы, такие как Biofill ®. [1] Другим коммерческим продуктом для лечения микробной целлюлозы является XCell, производимый корпорацией Xylos, который в основном используется для лечения ран от венозных язв . [45] Также были проведены исследования, в которых традиционные марлевые повязки обрабатывались микробным целлюлозным биополимером для улучшения свойств марли. Помимо увеличения времени высыхания и способности удерживать воду, жидкие лекарства могли впитываться микробной целлюлозной марлей, что позволяло им работать в месте повреждения. [46]
Микробная целлюлоза также использовалась для внутренних процедур, таких как костные трансплантаты и другая тканевая инженерия и регенерация. Ключевой способностью микробной целлюлозы для медицинских применений является то, что ее можно легко формовать в различные формы, сохраняя при этом все ее полезные свойства. Формуя микробную целлюлозу в длинные полые трубки, их можно использовать в качестве замещающих структур для нескольких различных областей, таких как сердечно-сосудистая система , пищеварительный тракт , мочевыводящие пути или трахея . Недавнее применение микробной целлюлозы было в качестве синтетических кровеносных сосудов и стентов . Целлюлозу также можно моделировать в сетчатые мембраны, которые можно использовать для внутренних замещающих структур, таких как внешняя мембрана мозга, твердая мозговая оболочка . Помимо замены, эти структуры также использовались в качестве трансплантатов для взаимодействия с существующим внутренним биологическим материалом. Микробная целлюлоза также использовалась в направленной регенерации тканей . [45] Bioprocess ® и Gengiflex ® — некоторые из распространенных товарных знаков микробной целлюлозы, которые теперь широко применяются в хирургии и дентальных имплантатах. Один из примеров включает восстановление тканей пародонта путем отделения эпителиальных клеток полости рта и соединительных тканей десны от обработанной поверхности корня. [1]
Областью активных исследований микробной целлюлозы является область электронной бумаги . В настоящее время растительная целлюлоза используется для производства основной массы традиционной бумаги, но из-за ее низкой чистоты ее необходимо смешивать с другими веществами, такими как лигнин . Однако из-за более высокой чистоты микробной целлюлозы и ее микрофибриллярной структуры она может оказаться отличным кандидатом на роль подложки для электронной бумаги. Микробную целлюлозу можно формировать в листы толщиной около 100 микрометров, что примерно соответствует толщине обычной бумаги, с помощью процесса мокрого синтеза. Микробная целлюлоза производит прочную подложку с микрофибриллярной структурой, которая позволяет имплантировать в бумагу легирующие вещества . Путем нанесения растворов на микробную целлюлозную бумагу в микрофибриллярную структуру можно поместить проводящие легирующие вещества и электрохромные красители . Бистабильные красители изменяют цвет с прозрачного на темный при приложении соответствующих напряжений , которые при помещении в пиксельную структуру позволят формировать изображения. Эта технология все еще находится на стадии исследования и еще не масштабирована до уровня коммерческого производства. Дальнейшие исследования были проведены для применения бактериальной целлюлозы в качестве субстрата в электронных устройствах с потенциалом использования в качестве электронных книг-планшетов, электронных газет, динамических обоев, перезаписываемых карт и учебных пособий. [47] Другим возможным примером использования бактериальной целлюлозы в электронной промышленности является производство органических светодиодов (OLED). [35]
Из-за неэффективного процесса производства текущая цена бактериальной целлюлозы остается слишком высокой, чтобы сделать ее коммерчески привлекательной и жизнеспособной в больших масштабах. [35] Традиционные методы производства не позволяют производить микробную целлюлозу в коммерческих количествах, поэтому необходимо достичь дальнейшего прогресса в производстве на основе реакторов, чтобы иметь возможность продавать множество продуктов из микробной целлюлозы. [29]