Высокопроизводительная тонкослойная хроматография ( ВЭТСХ ) служит расширением тонкослойной хроматографии (ТСХ), предлагая надежность, простоту, скорость и эффективность в количественном анализе соединений. [1] Этот аналитический метод на основе ТСХ улучшает разрешение соединений для количественного анализа. Некоторые из этих улучшений включают использование высококачественных пластин ТСХ с более мелкими размерами частиц в неподвижной фазе, что приводит к улучшенному разрешению. [2] Кроме того, разделение может быть дополнительно улучшено путем повторного проявления пластин с использованием устройства многократного проявления. В результате ВЭТСХ обеспечивает превосходное разрешение и более низкий предел обнаружения (LOD). [3]
Преимущества ВЭТСХ: [1]
ВЭТСХ включает три режима: линейный режим, круговой режим и антикруговой режим. Среди этих режимов антикруговой режим выделяется как самый быстрый в теории и на практике в области ВЭТСХ. Этот режим достигает разделения, позволяя подвижной фазе входить в слой пластины точно по внешнему круговому пути, после чего она течет к центру с почти постоянной скоростью. Такой подход максимизирует емкость образца, минимизируя при этом время, слой и потребление подвижной фазы, что делает его наиболее экономически эффективным методом ВЭТСХ. Узкий путь пятна, уникальный для антикругового ВЭТСХ, облегчает автоматическую количественную оценку. По сравнению с линейным и круговым режимами, антикруговой режим демонстрирует превосходное разделение и значительно повышенную чувствительность, особенно при более высоких значениях Rf. [2]
Для начала ВЭТСХ необходимо определить неподвижную фазу для разделения различных соединений в смеси. Около 90% всех фармацевтических разделений выполняются на силикагеле с нормальной фазой; однако для образцов с диссоциирующими соединениями можно использовать другие неподвижные фазы, такие как оксид алюминия , а для ионных соединений — целлюлозу. [4] Метод ВЭТСХ с обращенной фазой (аналогичная методология обращенно-фазовой ТСХ) используется для соединений с высокой полярностью. После выбора неподвижной фазы пластины обычно промывают метанолом и сушат в печи для удаления избытка растворителя. [5]
Выбор подвижной фазы является одним из важнейших процессов ВЭТСХ и осуществляется методом «проб и ошибок». Однако система « ПРИЗМА » выступает в качестве руководства для поиска оптимальной подвижной фазы. [1] Подвижная фаза зависит от поглощающей способности неподвижной фазы и состава интересующего соединения. [5] Сначала соединение тестируется с такими растворами, как диэтиловый эфир , этанол , дихлорметан , хлороформ для нормальной фазы ВЭТСХ или такими растворами, как метанол , ацетонитрил и тетрагидрофуран для обращенно-фазовой ВЭТСХ. Затем анализируются факторы замедления ( R f ) соединений с выбранным растворителем, и растворитель, который дает наибольший R f , выбирается в качестве подвижной фазы для соединения. Затем прочность подвижного растворителя тестируется против гексана (для нормальной ВЭТСХ) и воды (для обращенно-фазовой ВЭТСХ), чтобы определить необходимость корректировки. [5] [6]
Известные устройства ВЭТСХ, такие как Linomat 5 и Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4) от CAMAG, функционируют очень похоже, имея автоматизированную технику нанесения образца «напылением». [4] [5] Эта автоматизированная техника «напыления» полезна для преодоления неопределенности в размере и положении капель, когда образец наносится на пластину ТСХ вручную. Кроме того, автоматизация обеспечивает высокое разрешение и узкие полосы, поскольку растворитель испаряется немедленно, как только образец вступает в контакт с пластиной. [4] Одним из подходов к автоматизации было использование пьезоэлектрических устройств и струйных принтеров для нанесения образца. [7] В качестве альтернативы Nanomat 4 и ATS 4 от CAMAG управляются вручную, когда образец наносится точечно с помощью капиллярной пипетки. [4] [5]
При хроматографическом обнаружении пластины ВЭТСХ обычно проявляются в насыщенных двухлотковых камерах с фильтровальной бумагой для получения оптимальных результатов. [5] [6] Однако для определенных соединений также используются камеры с плоским дном и камеры с горизонтальным проявлением. Общий механизм для устройства ВЭТСХ выглядит следующим образом. [5] Подогнанная фильтровальная бумага помещается в задний желоб камеры, а подвижная фаза выливается через задний желоб, чтобы обеспечить полное поглощение растворителя фильтровальной бумагой. Затем камеру наклоняют на ~45°, чтобы оба желоба имели одинаковый объем растворителя, и оставляют в покое для уравновешивания в течение ~20 минут. [5] Наконец, пластина ВЭТСХ помещается в камеру для проявления. Между каждым считыванием образца подвижная фаза и фильтровальная бумага меняются, чтобы обеспечить наилучшие результаты.
Емкость пятна (аналогичная пиковой емкости в ВЭЖХ ) может быть увеличена путем проявления пластины двумя различными растворителями с использованием двумерной хроматографии . [8] Процедура начинается с проявления пластины с образцом, загруженным первым растворителем. После его удаления пластину поворачивают на 90° и проявляют вторым растворителем.
ВЭТСХ находит широкое применение в различных областях, включая фармацевтическую промышленность, клиническую химию, судебную химию, биохимию, косметологию, анализ пищевых продуктов и лекарств, анализ окружающей среды и многое другое, благодаря своим многочисленным преимуществам. Он отличается тем, что является единственным хроматографическим методом, способным представлять результаты в виде изображений, и предлагает простоту, экономичность, параллельный анализ образцов, высокую емкость образцов, быстрые результаты и возможность использования нескольких методов обнаружения.
Исследовательская группа Ле Ру оценила ВЭТСХ для определения уровня сальбутамола в сыворотке в клинических испытаниях и пришла к выводу, что это подходящий метод для анализа образцов сыворотки. [3]
HPTLC также успешно применялась для разделения различных подклассов липидов, с воспроизводимыми и многообещающими результатами, полученными для 20 различных подклассов липидов. Многочисленные отчеты, связанные с клиническими медицинскими исследованиями, были опубликованы в различных журналах. В результате HPTLC теперь настоятельно рекомендуется для анализа лекарственных препаратов в сыворотке и других тканях. [7]