stringtranslate.com

Вирусная метагеномика

Экологическое дробовое секвенирование (ESS)
         (A) Отбор проб из среды обитания
         (B) Фильтрация частиц, как правило, по размеру
         (C) Лизис и извлечение ДНК
         (D) Клонирование и создание библиотеки
         (E) Секвенирование клонов
         (F) Сборка последовательностей в контиги и каркасы

Вирусная метагеномика использует метагеномные технологии для обнаружения вирусного геномного материала из различных образцов окружающей среды и клинических образцов. [1] [2] Вирусы являются наиболее распространенной биологической сущностью и чрезвычайно разнообразны; однако, только небольшая часть вирусов была секвенирована, и только еще меньшая часть была выделена и культивирована. [1] [3] Секвенирование вирусов может быть сложной задачей, поскольку вирусы не имеют универсально сохраняющегося гена-маркера, поэтому подходы, основанные на генах, ограничены. [3] [4] Метагеномика может использоваться для изучения и анализа некультивируемых вирусов и является важным инструментом для понимания вирусного разнообразия и распространенности, а также для открытия новых вирусов. [1] [5] [6] Например, методы метагеномики использовались для описания вирусов, связанных с раковыми опухолями и в наземных экосистемах. [7]

История

Традиционные методы обнаружения, характеристики и присвоения вирусной таксономии вирусам основывались на выделении вирусной частицы или ее нуклеиновой кислоты из образцов. [8] Морфологию вируса можно было визуализировать с помощью электронной микроскопии, но только если вирус можно было выделить в достаточно высоком титре для обнаружения. Вирус можно было культивировать в эукариотических клеточных линиях или бактериях, но только если был известен соответствующий тип клетки-хозяина, а нуклеиновая кислота вируса могла быть обнаружена с помощью ПЦР, но только если был известен консенсусный праймер. [8]

Метагеномика не требует предварительных знаний вирусного генома, поскольку не требует универсального гена-маркера, праймера или конструкции зонда. [9] Поскольку этот метод использует инструменты прогнозирования для обнаружения вирусного содержимого образца, его можно использовать для идентификации новых видов вирусов или отличающихся членов известных видов.

Самые ранние метагеномные исследования вирусов были проведены на образцах океана в 2002 году. Последовательности, которые были сопоставлены с контрольными последовательностями, в основном представляли собой двухцепочечные ДНК бактериофагов и двухцепочечные вирусы водорослей. [10]

В 2016 году Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) официально признал, что вирусные геномы, собранные из метагеномных данных, можно классифицировать, используя те же процедуры, что и вирусы, выделенные с помощью классических подходов вирусологии. [11]

Вызовы

Вирусная темная материя

В исследовании метагеномики 2002 года ученые обнаружили, что 65% последовательностей ДНК и РНК вирусов не имели соответствий в справочных базах данных. [10] Это явление несовпадения вирусных последовательностей в справочных базах данных последовательностей распространено в исследованиях вирусной метагеномики и называется «вирусной темной материей». [3] [8] Оно в основном вызвано отсутствием полных последовательностей вирусного генома различных образцов в справочных базах данных и быстрой скоростью вирусной эволюции. [3] [8]

Разнообразие типов нуклеиновых кислот вирусов

В дополнение к этим проблемам, существует семь классов вирусов, основанных на системе классификации Балтимора, которая группирует вирусы на основе их геномной структуры и способа транскрипции: есть вирусы с двухцепочечной ДНК, вирусы с одноцепочечной ДНК, вирусы с двухцепочечной РНК и вирусы с одноцепочечной РНК. [12] Одноцепочечная РНК может быть положительной или отрицательной. Эти различные типы нуклеиновых кислот требуют различных подходов к секвенированию, и не существует универсального генного маркера, который был бы консервативен для всех типов вирусов. [3] [4] Подходы, основанные на генах, могут быть нацелены только на определенные группы вирусов (например, вирусы с РНК, которые разделяют консервативную последовательность РНК-полимеразы). [3] [4]

ДНК-вирусная предвзятость

В справочных базах данных все еще сохраняется предвзятость в сторону ДНК-вирусов. Распространенные причины этого предвзятого отношения заключаются в том, что РНК-вирусы мутируют быстрее, чем ДНК-вирусы, ДНК легче обрабатывать из образцов, тогда как РНК нестабильна, и для анализа метагеномики РНК (обратная транскрипция) требуется больше шагов. [4] [8]

Последовательность загрязнения

Последовательности могут быть загрязнены последовательностями организма-хозяина, что особенно проблематично, если организм-хозяин вируса неизвестен. [4] Также может иметь место загрязнение в результате извлечения нуклеиновых кислот и ПЦР. [4]

Методы

Нецелевая метагеномика

Метагеномный анализ использует секвенирование всего генома методом дробовика для характеристики микробного разнообразия в клинических и экологических образцах. Общая ДНК и/или РНК извлекаются из образцов и готовятся в библиотеке ДНК или РНК для секвенирования. [9] Эти методы использовались для секвенирования всего генома вируса Эпштейна-Барр (EBV) и HCV , однако загрязнение нуклеиновых кислот хозяина может повлиять на чувствительность к целевому вирусному геному, при этом доля прочтений, связанных с целевой последовательностью, часто бывает низкой. [13] [14]

Система IMG/VR и IMG/VR v.2.0 являются крупнейшими интерактивными общедоступными базами данных вирусов с более чем 760 000 метагеномных вирусных последовательностей и изолятами вирусов и служат отправной точкой для анализа последовательностей вирусных фрагментов, полученных из метагеномных образцов. [15] [16]

Целевая метагеномика: секвенирование ампликонов

В то время как нецелевая метагеномика и метатранскриптомика не нуждаются в генетическом маркере, секвенирование ампликона нуждается в нем. Оно использует ген, который высококонсервативен в качестве генетического маркера, но из-за разнообразных типов нуклеиновых кислот используемый маркер должен быть для определенных групп вирусов. [3] [4] Это делается с помощью ПЦР-амплификации праймеров, которые комплементарны известной, высококонсервативной нуклеотидной последовательности. [9] Затем за ПЦР следуют методы секвенирования всего генома , и он использовался для отслеживания эпидемий вируса Эбола [17] , вируса Зика [18] и COVID-19 [19] . Секвенирование ампликона с помощью ПЦР более успешно для секвенирования всего генома образцов с низкими концентрациями. Однако при более крупных вирусных геномах и гетерогенности РНК-вирусов может потребоваться несколько перекрывающихся праймеров для покрытия амплификации всех генотипов. Для секвенирования ампликонов методом ПЦР требуются знания вирусного генома до секвенирования, соответствующие праймеры, и оно сильно зависит от титров вируса, однако секвенирование ампликонов методом ПЦР является более дешевым методом оценки, чем метагеномное секвенирование при изучении известных вирусов с относительно небольшими геномами. [9]

Целевая метагеномика: обогащение зондами

Обогащение мишени — это независимый от культуры метод, который секвенирует вирусные геномы непосредственно из образца с использованием небольших зондов РНК или ДНК, комплементарных референсной последовательности патогенов. Зонды, которые могут быть связаны с твердой фазой, захватывают и вытягивают комплементарные последовательности ДНК в образце. [9] Наличие перекрывающихся зондов повышает толерантность к несовпадениям праймеров, но их разработка требует больших затрат и времени, поэтому быстрый ответ ограничен. Захват ДНК сопровождается коротким циклом ПЦР и дробовым секвенированием. Успех этого метода зависит от доступных референсных последовательностей для создания зондов и не подходит для характеристики новых вирусов. [9] Этот метод использовался для характеристики больших и малых вирусов, таких как HCV , [14] HSV-1 , [20] и HCMV . [21]

Ограничения

Методы вирусной метагеномики могут создавать ошибочные химерные последовательности. [22] [23] Они могут включать артефакты in vitro от амплификации и артефакты in silico от сборки. [23] Химеры могут образовываться между неродственными вирусами, а также между вирусными и эукариотическими последовательностями. [23] Вероятность ошибок частично снижается за счет большей глубины секвенирования, но химеры все еще могут образовываться в областях с высоким покрытием, если прочтения сильно фрагментированы. [22]

Приложения

Сельское хозяйство

Вирусы растений представляют глобальную угрозу для производства сельскохозяйственных культур, но посредством метагеномного секвенирования и создания вирусной базы данных модифицированные вирусы растений могут быть использованы для помощи в иммунитете растений, а также для изменения внешнего вида. [24] Данные, полученные о геномах вирусов растений с помощью метагеномного секвенирования, могут быть использованы для создания клонированных вирусов для инокуляции растений с целью изучения вирусных компонентов и биологической характеристики вирусных агентов с повышенной воспроизводимостью. Сконструированные мутантные штаммы вирусов использовались для изменения окраски и размера различных декоративных растений и улучшения здоровья сельскохозяйственных культур. [25]

Экология

Вирусная метагеномика способствует классификации вирусов без необходимости в методологиях, основанных на культуре, и предоставила обширные знания о вирусном разнообразии в любой системе. Метагеномика может использоваться для изучения воздействия вирусов на данную экосистему и того, как они влияют на микробиом, а также для мониторинга вирусов в экосистеме на предмет возможного распространения на популяции людей. [1] В экосистемах вирусы могут изучаться для определения того, как они конкурируют друг с другом, а также вирусного воздействия на функции хозяина. Вирусная метагеномика использовалась для изучения некультивируемых вирусных сообществ в морских и почвенных экосистемах. [7] [26]

Исследования инфекционных заболеваний

Вирусная метагеномика легко используется для обнаружения новых вирусов, с основным акцентом на зоонозных или патогенных для человека. Вирусные базы данных, полученные с помощью метагеномики, предоставляют методы быстрого реагирования для определения вирусных инфекций, а также определения вариантов, устойчивых к лекарствам, в клинических образцах. [9] Вклад вирусной метагеномики в вирусную классификацию помог усилиям по наблюдению за пандемиями, а также сделал наблюдение за инфекционными заболеваниями и тестирование более доступными. [27] Поскольку большинство пандемий у людей имеют зоонозное происхождение, метагеномное наблюдение может обеспечить более быструю идентификацию новых вирусов и их резервуаров. [28]

Одной из таких программ наблюдения является Глобальный проект Virome (GVP) — международная совместная исследовательская инициатива, базирующаяся в Институте One Health Калифорнийского университета в Дэвисе . [29] [30] Целью GVP является усиление надзора за инфекционными заболеваниями во всем мире путем использования недорогих методов секвенирования в странах с высоким риском для предотвращения вспышек заболеваний и предотвращения будущих вспышек вирусов. [27] [31]

Лекарство

Вирусная метагеномика использовалась для тестирования на вирусные виды рака и трудно диагностируемые случаи в клинической диагностике. [31] Этот метод чаще всего используется, когда обычные и передовые молекулярные тесты не могут найти возбудителя заболевания. Метагеномное секвенирование также может использоваться для обнаружения патогенных вирусов в клинических образцах и предоставления данных в реальном времени о наличии патогенов в популяции. [28]

Методы, используемые для клинической вирусной метагеномики, не стандартизированы, но Европейским обществом клинической вирусологии были опубликованы руководящие принципы. [32] [33] Для клинической вирусной метагеномики используется смесь различных платформ секвенирования, наиболее распространенными из которых являются инструменты от Illumina и Oxford Nanopore Technologies . Существует также несколько различных протоколов, как для работы в мокрой лаборатории, так и для биоинформатического анализа, которые используются. [34]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcd Sommers P, Chatterjee A, Varsani A, Trubl G (сентябрь 2021 г.). «Интеграция вирусной метагеномики в экологическую структуру». Annual Review of Virology . 8 (1): 133–158. doi : 10.1146/annurev-virology-010421-053015 . PMID  34033501.
  2. ^ Grasis JA (2018). «Выделение и подготовка ассоциированного с хозяином бактериофага для вирусной метагеномики». Вирусная метагеномика . Методы в молекулярной биологии. Т. 1746. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer New York. С. 1–25. doi : 10.1007/978-1-4939-7683-6_1. ISBN 978-1-4939-7682-9. PMID  29492882. S2CID  3637163 . Получено 2022-12-02 .
  3. ^ abcdefg Krishnamurthy SR, Wang D (июль 2017 г.). «Истоки и проблемы вирусной темной материи». Virus Research . 239 : 136–142. doi : 10.1016/j.virusres.2017.02.002. PMID  28192164.
  4. ^ abcdefg Паппас Н, Ру С, Хельцер М, Ламкевич К, Мок Ф, Марц М, Дутиль Б. Э. (2021). «Вирусная биоинформатика». В Бэмфорд Д. Х., Цукерман М (ред.). Энциклопедия вирусологии (4-е изд.). Elsevier. стр. 124–132. doi :10.1016/b978-0-12-814515-9.00034-5. ISBN 978-0-12-814516-6. ЧМЦ  7567488 .
  5. ^ Кристенсен ДМ, Мушегян А.Р., Доля В.В., Кунин Е.В. (январь 2010 г.). «Новые измерения вирусного мира, открытые с помощью метагеномики». Тенденции в микробиологии . 18 (1): 11–19. doi :10.1016/j.tim.2009.11.003. PMC 3293453. PMID  19942437 . 
  6. ^ Бернардо П., Альбина Э., Элуа М., Руманьяк П. (май 2013 г.). «[Патология и вирусная метагеномика, недавняя история]». Médecine/Sciences (на французском языке). 29 (5): 501–508. doi : 10.1051/medsci/2013295013 . PMID  23732099.
  7. ^ ab Alavandi SV, Poornima M (сентябрь 2012 г.). «Вирусная метагеномика: инструмент для обнаружения вирусов и изучения разнообразия в аквакультуре». Indian Journal of Virology . 23 (2): 88–98. doi :10.1007/s13337-012-0075-2. PMC 3550753. PMID  23997432 . 
  8. ^ abcde Сантьяго-Родригес TM, Холлистер EB (2022-09-16). «Раскрытие вирусной темной материи посредством вирусной метагеномики». Frontiers in Immunology . 13. doi : 10.3389/fimmu.2022.1005107 . ISSN  1664-3224. PMC 9523745. PMID 36189246  . 
  9. ^ abcdefg Houldcroft CJ, Beale MA, Breuer J (март 2017 г.). «Клинические и биологические выводы из секвенирования вирусного генома». Nature Reviews. Microbiology . 15 (3): 183–192. doi :10.1038/nrmicro.2016.182. PMC 7097211. PMID 28090077  . 
  10. ^ ab Breitbart M, Salamon P, Andresen B, Mahaffy JM, Segall AM, Mead D, et al. (октябрь 2002 г.). «Геномный анализ некультивируемых морских вирусных сообществ». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 99 (22): 14250–14255. Bibcode : 2002PNAS...9914250B. doi : 10.1073/pnas.202488399 . PMC 137870. PMID  12384570 . 
  11. ^ Simmonds P, Adams MJ, Benkő M, Breitbart M, Brister JR, Carstens EB и др. (март 2017 г.). «Консенсусное заявление: таксономия вирусов в эпоху метагеномики». Nature Reviews. Microbiology . 15 (3): 161–168. doi : 10.1038/nrmicro.2016.177 . hdl : 1887/114573 . PMID  28134265. S2CID  1478314.
  12. ^ Koonin EV, Krupovic M, Agol VI (18.08.2021). «Балтиморская классификация вирусов 50 лет спустя: как она выглядит в свете эволюции вирусов?». Microbiology and Molecular Biology Reviews . 85 (3): e0005321. doi :10.1128/MMBR.00053-21. ISSN  1092-2172. PMC 8483701. PMID 34259570  . 
  13. ^ Depledge DP, Palser AL, Watson SJ, Lai IY, Gray ER, Grant P и др. (18.11.2011). Jhaveri R (ред.). «Специфический захват и секвенирование всего генома вирусов из клинических образцов». PLOS ONE . 6 (11): e27805. Bibcode : 2011PLoSO...627805D. doi : 10.1371/journal.pone.0027805 . PMC 3220689. PMID  22125625 . 
  14. ^ ab Thomson E, Ip CL, Badhan A, Christiansen MT, Adamson W, Ansari MA и др. (октябрь 2016 г.). «Сравнение технологий секвенирования следующего поколения для комплексной оценки полноразмерных геномов вируса гепатита С». Журнал клинической микробиологии . 54 (10): 2470–2484. doi :10.1128/jcm.00330-16. PMC 5035407. PMID 27385709  . 
  15. ^ Паес-Эспино Д., Чен И.А., Паланиаппан К., Ратнер А., Чу К., Сзето Э. и др. (январь 2017 г.). «IMG/VR: база данных культивируемых и некультивируемых ДНК-вирусов и ретровирусов». Исследования нуклеиновых кислот . 45 (Д1): Д457–Д465. дои : 10.1093/nar/gkw1030. ПМК 5210529 . ПМИД  27799466. 
  16. ^ Paez-Espino D, Roux S, Chen IA, Palaniappan K, Ratner A, Chu K и др. (январь 2019 г.). «IMG/VR v.2.0: интегрированная система управления и анализа данных для культивируемых и экологических вирусных геномов». Nucleic Acids Research . 47 (D1): D678–D686. doi :10.1093/nar/gky1127. PMC 6323928 . PMID  30407573. 
  17. ^ Quick J (25.09.2019). "Протокол секвенирования вируса Эбола, версия 1". Protocols.io . doi :10.17504/protocols.io.7nwhmfe. S2CID  216572035 . Получено 30.11.2022 .
  18. ^ Влахакис Д., Папагеоргиу Л., Мегалуиконому В. (13.06.2018), «Генетический и геоэпидемиологический анализ пандемии вируса Зика; извлечение уроков из недавней вспышки Эболы», Current Topics in Zika , InTech, doi : 10.5772/intechopen.71505 , ISBN 978-1-78923-270-7, S2CID  90434818
  19. ^ Charre C, Ginevra C, Sabatier M, Regue H, Destras G, Brun S и др. (Июль 2020 г.). «Оценка подходов на основе NGS для характеристики всего генома SARS-CoV-2». Virus Evolution . 6 (2): veaa075. bioRxiv 10.1101/2020.07.14.201947 . doi : 10.1093/ve/veaa075 . PMC 7665770 . PMID  33318859.  
  20. ^ Эберт К, Депледж ДП, Брейер Дж, Харман Л, Эллиотт Г (сентябрь 2013 г.). «Способ спасения вируса определяет приобретение мутаций VHS у VP22-отрицательного вируса простого герпеса 1». Журнал вирусологии . 87 (18): 10389–10393. doi :10.1128/jvi.01654-13. PMC 3753997. PMID  23864617 . 
  21. ^ Depledge DP, Palser AL, Watson SJ, Lai IY, Gray ER, Grant P и др. (2011-11-18). «Специфический захват и секвенирование всего генома вирусов из клинических образцов». PLOS ONE . 6 (11): e27805. Bibcode : 2011PLoSO...627805D. doi : 10.1371/journal.pone.0027805 . PMC 3220689. PMID  22125625 . 
  22. ^ ab García-López R, Vázquez-Castellanos JF, Moya A (сентябрь 2015 г.). "Фрагментация и вариабельность покрытия в вирусных метагеномных сборках и их влияние на расчеты разнообразия". Frontiers in Bioengineering and Biotechnology . 3 : 141. doi : 10.3389/fbioe.2015.00141 . PMC 4585024. PMID  26442255. 
  23. ^ abc Arroyo Mühr LS, Lagheden C, Hassan SS, Kleppe SN, Hultin E, Dillner J (август 2020 г.). «Сборка последовательности de novo требует биоинформатической проверки химерных последовательностей». PLOS ONE . ​​15 (8): e0237455. Bibcode :2020PLoSO..1537455A. doi : 10.1371/journal.pone.0237455 . PMC 7417191 . PMID  32777809. 
  24. ^ Brewer HC, Hird DL, Bailey AM, Seal SE, Foster GD (апрель 2018 г.). «Руководство по ограниченному использованию инфекционных клонов вирусов растений». Plant Biotechnology Journal . 16 (4): 832–843. doi :10.1111/pbi.12876. PMC 5867029. PMID  29271098 . 
  25. ^ Pasin F, Menzel W, Daròs JA (июнь 2019 г.). «Используемые вирусы в эпоху метагеномики и синтетической биологии: обновление информации о сборке инфекционных клонов и биотехнологиях вирусов растений». Plant Biotechnology Journal . 17 (6): 1010–1026. doi :10.1111/pbi.13084. PMC 6523588. PMID  30677208 . 
  26. ^ Pratama AA, van Elsas JD (август 2018 г.). ««Забытый» почвенный виром — потенциальная роль и воздействие». Trends in Microbiology . 26 (8): 649–662. doi :10.1016/j.tim.2017.12.004. PMID  29306554. S2CID  25057850.
  27. ^ ab Schmidt C (октябрь 2018 г.). «Охотники за виромами». Nature Biotechnology . 36 (10): 916–919. doi : 10.1038/nbt.4268. PMC 7097093. PMID  30307913. 
  28. ^ ab Roux S, Matthijnssens J, Dutilh BE (2021), «Метагеномика в вирусологии», Энциклопедия вирусологии , Elsevier, стр. 133–140, doi :10.1016/b978-0-12-809633-8.20957-6, ISBN 978-0-12-814516-6, ЧМЦ  7157462
  29. ^ Верниммен Т (16.04.2020). «Инфекционные заболевания: создание и разрушение связи с животными». Журнал Knowable | Annual Reviews . doi : 10.1146/knowable-041620-1 . S2CID  218810265.
  30. ^ "Контакт". Global Virome Project . Архивировано из оригинала 2022-08-22 . Получено 2022-08-22 .
  31. ^ ab Dutilh BE, Reyes A, Hall RJ, Whiteson KL (сентябрь 2017 г.). «Редакционная статья: открытие вирусов с помощью метагеномики: (не)возможности». Frontiers in Microbiology . 8 (1710): 1710. doi : 10.3389/fmicb.2017.01710 . PMC 5596103 . PMID  28943867. 
  32. ^ Лопес-Лабрадор FX, Браун-младший, Фишер Н, Харвала Х, Ван Бохемен С, Синек О, Сайнер А, Мэдсен ТВ, Овинен Э, Куфнер В, Хубер М, Родригес С, Йонгес М, Хёнеманн М, Сьюзи П (2021) -01-01). «Рекомендации по внедрению метагеномного высокопроизводительного секвенирования в клиническую вирусологию, часть I: Влажная лабораторная процедура». Журнал клинической вирусологии . 134 : 104691. doi : 10.1016/j.jcv.2020.104691. hdl : 10261/257819 . ISSN  1386-6532.
  33. ^ де Врис Дж.Дж., Браун Дж.Р., Коуто Н., Бир М., Ле Мерсье П., Сидоров И., Папа А., Фишер Н., Оуде Маннинк Б.Б., Родригес С., Захери М., Сайнер А., Хёнеманн М., Перес-Каталунья А, Карбо EC (01.05.2021). «Рекомендации по внедрению метагеномного секвенирования нового поколения в клиническую вирусологию, часть II: биоинформатический анализ и отчетность». Журнал клинической вирусологии . 138 : 104812. doi : 10.1016/j.jcv.2021.104812. hdl : 1887/3249096 . ISSN  1386-6532.
  34. ^ Lopez-Labrador FX, Huber M, Sidorov IA, Brown JR, Cuypers L, Laenen L, Vanmechelen B, Maes P, Fischer N, Pichler I, Storey N, Atkinson L, Schmutz S, Kufner V, van Boheemen S (2024-08-01). "Многоцентровой сравнительный анализ протоколов лабораторных исследований с коротким и длинным прочтением для клинической вирусной метагеномики". Журнал клинической вирусологии . 173 : 105695. doi : 10.1016/j.jcv.2024.105695. ISSN  1386-6532.

Внешние ссылки