Замороженный зоопарк — это хранилище, в котором генетические материалы, взятые у животных (например, ДНК , сперма , яйцеклетки , эмбрионы и живые ткани), хранятся при очень низких температурах (−196 °C) в резервуарах с жидким азотом. [1] Материал, сохраненный таким образом, может храниться неограниченное время [2] и использоваться для искусственного оплодотворения , экстракорпорального оплодотворения , переноса эмбрионов и клонирования . В мире есть несколько замороженных зоопарков, которые применяют эту технологию для сохранения видов. Несколько различных видов были введены в эту технологию, включая пиренейского козерога, черноногого хорька и, возможно, белого носорога.
Первый замороженный зоопарк был создан в зоопарке Сан-Диего патологом Куртом Бениршке в 1972 году. [3] [4] [5] В то время не было технологий, позволяющих использовать коллекцию, но Бениршке верил, что такие технологии будут разработаны в будущем. [6] Идея замороженного зоопарка была позже поддержана в статье Грегори Бенфорда 1992 года, в которой предлагалось создать Библиотеку жизни. [7] Зоопарки, такие как зоопарк Сан-Диего, и исследовательские программы, такие как Центр исследований исчезающих видов Одюбона [8] [2] криоконсервируют генетический материал, чтобы защитить разнообразие генофонда исчезающих видов или обеспечить перспективную реинтродукцию таких вымерших видов, как тасманийский тигр [9] и мамонт . [10]
Сбор материала для замороженного зоопарка упрощается из-за обилия спермы у самцов. Сперму можно взять у животного после смерти. Производство яйцеклеток, которое у самок обычно низкое, можно увеличить с помощью гормональной обработки , чтобы получить 10–20 ооцитов , в зависимости от вида. Некоторые замороженные зоопарки предпочитают оплодотворять яйцеклетки и замораживать полученный эмбрион, поскольку эмбрионы более устойчивы в процессе криоконсервации. [11] Некоторые центры также собирают образцы клеток кожи находящихся под угрозой исчезновения животных или вымерших видов. Научно-исследовательский институт Скриппса успешно превратил клетки кожи в культуры специальных клеток, называемых индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками ( IPS-клетки ). Теоретически возможно производить сперму и яйцеклетки из этих IPS-клеток. [4]
Несколько животных, клетки которых были сохранены в замороженных зоопарках, были клонированы для увеличения генетического разнообразия исчезающих видов по состоянию на 2021 год [обновлять]. Одна попытка клонировать вымерший вид была предпринята в 2003 году; новорожденный пиренейский козерог умер от нарушения развития, которое могло быть связано с клонированием, и в замороженных зоопарках недостаточно генетических образцов для воссоздания популяции размножающихся пиренейских козерогов.
В настоящее время в замороженном зоопарке Института исследований в области охраны природы зоопарка Сан-Диего хранится коллекция из 8400 образцов более 800 видов и подвидов. [12] Он послужил предшественником подобных проектов в других зоопарках США и Европы. [13] [14] Однако в мире до сих пор насчитывается менее дюжины замороженных зоопарков. [2]
В Центре разведения исчезающих видов дикой природы Аравии (BCEAW) в Шардже в Объединенных Арабских Эмиратах хранятся эмбрионы, в том числе крайне уязвимого вида — дикой кошки Гордона ( Felis silvestris gordoni ) и аравийского леопарда ( Panthera pardus nimr ) (которых в дикой природе осталось всего 50 особей). [11]
Центр исследований исчезающих видов Одюбона, связанный с Университетом Нового Орлеана , содержит замороженный зоопарк. В 2000 году Центр имплантировал замороженный-оттаявший эмбрион африканской дикой кошки, находящейся под угрозой исчезновения, в матку домашней кошки, в результате чего появился здоровый самец дикой кошки. [15]
Frozen Ark — это замороженный зоопарк, основанный в 2004 году и совместно управляемый Лондонским зоологическим обществом , Лондонским музеем естественной истории и Ноттингемским университетом . [16] [17] Эта организация работает как благотворительная организация со множеством различных отделов, включая лабораторию ДНК, консорциум, группы экспертов по таксонам и базу данных. [18] В лаборатории ДНК образцы хранятся после сбора у ученых, и там проводятся различные исследовательские проекты. Консорциум выступает в качестве моста для объединения разных, но важных групп из зоопарков, аквариумов, музеев и университетов. Группы экспертов по таксонам отслеживают основные типы и списки, такие как Красный список МСОП. База данных является неотъемлемой частью, поскольку она содержит все отчеты и записи, необходимые для выполнения всех других функций благотворительной организации. [18] Надежда на будущее заключается в том, что зоопарки и аквариумы смогут собирать образцы своих находящихся под угрозой исчезновения и/или находящихся под угрозой исчезновения видов в своих домах, чтобы помочь в усилиях по сохранению. [18] Сбор и заморозка этих образцов позволяет распределить гаметы среди популяций. Образцы могут быть собраны как у живых хозяев, так и у умерших хозяев. [18] [19]
Центр регенеративной биологии Университета Джорджии строит замороженный зоопарк. Директор RBC Стивен Стайс и доцент кафедры животноводства и молочного хозяйства Франклин Уэст создали объект с мыслью о спасении исчезающих видов кошек. Ученые уже извлекли клетки из суматранского тигра , которые можно использовать для искусственного оплодотворения. Искусственное оплодотворение является средством для животных, которые по анатомическим или физиологическим причинам не могут размножаться естественным путем. Воспроизведение сохраненного генетического материала также позволяет стимулировать генетические улучшения и предотвращать инбридинг. Современные технологии позволяют проводить генетические манипуляции с животными, не держа их в неволе. Однако для успешного их восстановления в дикой природе потребуется применение новой науки и достаточного количества ранее собранного материала. [11]
Из-за очень низких требуемых температур образцы ДНК подвергаются различным уровням стресса. Сперматозоиды , в частности, подвергаются стрессу из-за температурного шока, осмотического стресса и окислительного стресса, причем последний является наиболее пагубным. [20] Когда происходит температурный шок, мембрана повреждается из-за замораживания и оттаивания спермы. Осмотический стресс возникает, когда внутри ядра во время процесса замораживания образуются кристаллы льда, вызывая различное осмотическое давление внутри клетки. Окислительный стресс является результатом слишком большого количества активных форм кислорода (ROS), которые являются высокореактивными и повреждают все части клетки. [20] [21] Хотя эти стрессоры присутствуют внутри клетки, существуют решения для каждого из них. Вводя холестерин в образцы, температурный шок можно уменьшить. Использование антифризных белков обеспечивает одно из решений для осмотического стресса. С окислительным стрессом труднее всего бороться из-за высокореактивных компонентов ROS, но некоторые меры, такие как добавление определенных белков, ограничивают повреждения при замораживании-оттаивании и увеличивают выживаемость ДНК. [20]
У гаура , умершего естественной смертью, были заморожены некоторые клетки кожи и добавлены в замороженный зоопарк Сан-Диего. Восемь лет спустя ДНК из этих клеток была введена в яйцеклетку домашней коровы для создания эмбриона (трансвидовое клонирование), который затем был имплантирован домашней корове ( Bos taurus ). 8 января 2001 года в городе Сиу-Сентер, штат Айова , родился гаур по имени Ной . Изначально Ной был здоров, но на следующий день он заболел клостридиальным энтеритом и умер от дизентерии в течение 48 часов после рождения. Это не редкость для неклонированных животных, и исследователи не думали, что это связано с клонированием. [22]
Бантенг был вторым успешно клонированным исчезающим видом и первым клоном, пережившим младенчество. [23] [24] Ученые из Advanced Cell Technology в Вустере, штат Массачусетс , извлекли ДНК из клеток кожи мертвого самца бантенга, которые были сохранены в замороженном зоопарке Сан-Диего, и перенесли ее в яйцеклетки домашних коров бантенга, процесс, называемый переносом ядра соматической клетки . Было создано тридцать эмбрионов и имплантировано домашним коровам бантенга. Двое были выношены и рождены с помощью кесарева сечения . Первый родился 1 апреля 2003 года, а второй — два дня спустя. Второй был подвергнут эвтаназии , по-видимому, страдая от синдрома большого потомства ( расстройство чрезмерного роста ), но первый выжил и прожил семь лет в зоопарке Сан-Диего, где он умер в апреле 2010 года после того, как сломал ногу и был подвергнут эвтаназии. [25] [26]
В 2020 году родилась первая клонированная лошадь Пржевальского , что стало результатом сотрудничества San Diego Zoo Global , ViaGen Equine и Revive & Restore . [27] Клонирование проводилось методом переноса ядра соматической клетки (SCNT), при котором жизнеспособный эмбрион создается путем трансплантации содержащего ДНК ядра соматической клетки в незрелую яйцеклетку ( ооцит ), у которой удалено собственное ядро, в результате чего получается потомство, генетически идентичное донору соматической клетки. [28] Поскольку использованный ооцит был от домашней лошади, это был пример межвидового SCNT. [29]
Донором соматических клеток был жеребец лошади Пржевальского по кличке Купорович, родившийся в Великобритании в 1975 году и переехавший три года спустя в США, где он умер в 1998 году. Из-за опасений по поводу потери генетической изменчивости в популяции лошадей Пржевальского в неволе и в ожидании разработки новых методов клонирования, ткань жеребца была криоконсервирована в Frozen Zoo зоопарка Сан-Диего. Разведение этой особи в 1980-х годах уже существенно увеличило генетическое разнообразие популяции в неволе, после того как было обнаружено, что у него было больше уникальных аллелей, чем у любой другой лошади, жившей в то время, включая иначе потерянный генетический материал от двух первоначальных основателей в неволе. [27] Для получения клона замороженные фибробласты кожи были разморожены и выращены в клеточной культуре . [30] Ооцит был взят у домашней лошади, а его ядро заменено ядром, взятым из культивированного фибробласта лошади Пржевальского. Полученный эмбрион был вызван для начала деления и культивировался до достижения стадии бластоцисты , затем имплантирован в суррогатную кобылу домашней лошади , [30] которая выносила эмбрион до срока и родила жеребенка с ДНК лошади Пржевальского давно умершего жеребца.
Клонированную лошадь назвали Куртом в честь доктора Курта Бениршке , генетика , который разработал идею криоконсервации генетического материала видов, считающихся находящимися под угрозой исчезновения. Его идеи привели к созданию Frozen Zoo как генетической библиотеки. [31] В сафари-парке зоопарка Сан-Диего есть племенное стадо . [32] Как только жеребенок вырастет, его переместят в племенное стадо в сафари-парке зоопарка Сан-Диего , [32] чтобы передать гены Купоровича в более крупную популяцию лошадей Пржевальского в неволе и увеличить генетическую изменчивость вида. [27]
Чтобы помочь смягчить инбридинговую депрессию для двух исчезающих видов, черноногих хорьков (Mustela nigripes) , Revive & Restore содействует постоянным усилиям по клонированию особей из исторических клеточных линий, хранящихся в San Diego Zoo Wildlife Alliance Frozen Zoo. Программа направлена на восстановление генетической изменчивости, утраченной из живого генофонда.
10 декабря 2020 года родился первый в мире клонированный черноногий хорек . Этот хорек, названный Элизабет Энн , стал первым успешным клонированием исчезающего вида в США. [33] [34]
Клетки двух диких черноногих хорьков, пойманных в 1980-х годах , которые никогда не размножались в неволе, были сохранены в замороженном зоопарке San Diego Wildlife Alliance. Один из них был клонирован для увеличения генетического разнообразия этого вида в декабре 2020 года. Планируется больше клонов обоих. Первоначально они будут разводиться отдельно от неклонированной популяции. [35]
Пиренейский козерог вымер в 2000 году. В 2003 году замороженные клетки последнего из них (самки, убитой падающей веткой) были использованы для клонирования 208 эмбрионов, из которых 7 успешно имплантировались козам, а один дожил до срока. Тот один козерог умер от дыхательной недостаточности сразу после рождения; вполне возможно, что в результате процесса клонирования его легкие не развились должным образом. Возможно, не сохранилось достаточно клеток особей для создания популяции для размножения. [36] [37] Несмотря на смерть козерога, анализ ДНК показал, что потомство было законным клоном от его последнего живого потомка. [38]
За прошедшие годы опасения по поводу сокращения популяции северного белого носорога ( Ceratotherium simum cottoni ) возросли из-за растущей ценности их рогов для браконьеров. В частности, популяция сократилась почти на семьдесят процентов с 2011 по 2019 год. [39] Такие процессы, как SCNT, могут помочь в усилиях по сохранению популяции, направленных на возрождение популяции. Исследователи ищут индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), поскольку они обладают безграничными возможностями. [40] В связи с отсутствием естественного спаривания, происходящего внутри вида из-за их ограниченного количества, этот подвид предоставляет исследователям возможность для вмешательства iPSC. Другие методы, включая искусственное осеменение свежей спермой (ИИ), были успешно использованы в другом подвиде, южном белом носороге ( Ceratotherium simum simum ). [41] Замороженная-размороженная сперма была протестирована и показала некоторые успехи, помогая решить проблемы с воспроизводством вида в целом. [41]