ДНК-полимераза I (или Pol I ) — фермент , участвующий в процессе репликации ДНК прокариот . Обнаруженная Артуром Корнбергом в 1956 году [1] , она была первой известной ДНК-полимеразой (и первой известной полимеразой любого типа ). Первоначально он был охарактеризован в E. coli и повсеместно встречается у прокариот . У E. coli и многих других бактерий ген , кодирующий Pol I, известен как polA . Фермент Pol I E. coli состоит из 928 аминокислот и является примером процессивного фермента — он может последовательно катализировать несколько стадий полимеризации, не высвобождая одноцепочечную матрицу. [2] Физиологическая функция Pol I заключается в основном в поддержке восстановления поврежденной ДНК, но он также способствует соединению фрагментов Оказаки путем удаления праймеров РНК и замены рибонуклеотидов ДНК.
В 1956 году Артур Корнберг и его коллеги открыли Pol I, используя экстракты Escherichia coli ( E. coli ) для разработки анализа синтеза ДНК. Ученые добавили тимидин, меченный 14 C, чтобы можно было получить радиоактивный полимер ДНК, а не РНК. Чтобы инициировать очистку ДНК-полимеразы, исследователи добавили сульфат стрептомицина к экстракту кишечной палочки . При этом экстракт разделялся на супернатант, не содержащий нуклеиновых кислот (S-фракция) и осадок, содержащий нуклеиновую кислоту (P-фракция). Р-фракция также содержала Pol I и термостабильные факторы, необходимые для реакций синтеза ДНК. Эти факторы были идентифицированы как нуклеозидтрифосфаты , строительные блоки нуклеиновых кислот. S-фракция содержала несколько дезоксинуклеозидкиназ . [3] В 1959 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Артуру Корнбергу и Северо Очоа «за открытие механизмов, участвующих в биологическом синтезе рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой кислоты ». [4]
Pol I в основном участвует в восстановлении поврежденной ДНК. Структурно Pol I является членом суперсемейства альфа/бета-белков, которое включает белки, в которых α-спирали и β-цепи встречаются в нерегулярных последовательностях. ДНК Pol I E. coli состоит из множества доменов с тремя различными ферментативными активностями. Три домена, часто называемые доменами большого пальца, пальца и ладони, работают вместе, чтобы поддерживать активность ДНК-полимеразы. [5] Четвертый домен рядом с доменом ладони содержит активный сайт экзонуклеазы , который удаляет неправильно включенные нуклеотиды в направлении от 3' к 5' в процессе, известном как корректура. Пятый домен содержит еще один активный сайт экзонуклеазы , который удаляет ДНК или РНК в направлении от 5' к 3' и необходим для удаления праймера РНК во время репликации ДНК или ДНК во время процессов репарации ДНК.
Бактерии E. coli продуцируют 5 различных ДНК-полимераз: ДНК Pol I, ДНК Pol II, ДНК Pol III, ДНК Pol IV и ДНК Pol V. [6]
При репликации ДНК ведущая цепь ДНК непрерывно удлиняется в направлении движения репликационной вилки, тогда как отстающая цепь ДНК прерывисто движется в противоположном направлении, как фрагменты Оказаки . [7] ДНК-полимеразы также не могут инициировать цепи ДНК, поэтому они должны инициироваться короткими сегментами РНК или ДНК, известными как праймеры. [5] Для того, чтобы произошла полимеризация ДНК, должны быть выполнены два требования. Прежде всего, все ДНК-полимеразы должны иметь как матричную цепь, так и праймерную цепь. В отличие от РНК, ДНК-полимеразы не могут синтезировать ДНК из матричной цепи. Синтез должен быть инициирован коротким сегментом РНК, известным как РНК-праймер , синтезируемым примазой в направлении от 5’ к 3’. Затем синтез ДНК происходит путем добавления dNTP к 3'-гидроксильной группе на конце ранее существовавшей цепи ДНК или праймера РНК. Во-вторых, ДНК-полимеразы могут добавлять новые нуклеотиды к уже существующей цепи только посредством водородных связей. [6] Поскольку все ДНК-полимеразы имеют схожую структуру, все они имеют полимеразный механизм, катализируемый ионами двух металлов. Один из ионов металла активирует 3'-гидроксильную группу праймера, которая затем атакует первичный 5'-фосфат dNTP. Второй ион металла стабилизирует отрицательный заряд уходящего кислорода и впоследствии хелатирует две уходящие фосфатные группы. [8]
Рентгенокристаллические структуры полимеразных доменов ДНК-полимераз описаны по аналогии с правыми руками человека. Все ДНК-полимеразы содержат три домена. Первый домен, известный как «домен пальцев», взаимодействует с dNTP и базой парного шаблона. «Домен пальцев» также взаимодействует с шаблоном, чтобы правильно расположить его на активном сайте. [9] Известный как «пальмовый домен», второй домен катализирует реакцию переноса фосфорильной группы. Наконец, третий домен, известный как «домен большого пальца», взаимодействует с двухцепочечной ДНК. [10] Домен экзонуклеазы содержит собственный каталитический сайт и удаляет неправильно спаренные основания. Среди семи различных семейств ДНК-полимераз «пальмовый домен» консервативен в пяти из этих семейств. «Домен пальца» и «домен большого пальца» не совпадают в каждом семействе из-за различий в элементах вторичной структуры из разных последовательностей. [9]
Pol I обладает четырьмя ферментативными активностями:
Чтобы определить, использовался ли Pol I в первую очередь для репликации ДНК или для восстановления повреждений ДНК, был проведен эксперимент с дефицитным мутантным штаммом Pol I E. coli . Мутантный штамм, в котором отсутствовал Pol I, был выделен и обработан мутагеном. У мутантного штамма образовались бактериальные колонии, которые продолжали нормально расти и в которых также отсутствовал Pol I. Это подтвердило, что Pol I не требуется для репликации ДНК. Однако мутантный штамм также продемонстрировал характеристики, которые включали чрезвычайную чувствительность к определенным факторам, повреждающим ДНК, таким как ультрафиолетовый свет . Таким образом, это подтвердило, что Pol I, скорее всего, будет участвовать в восстановлении повреждений ДНК, а не в репликации ДНК. [6]
В процессе репликации РНКаза H удаляет праймер РНК (созданный примазой ) из отстающей цепи , а затем полимераза I заполняет необходимые нуклеотиды между фрагментами Оказаки (см. Репликация ДНК ) в направлении 5'→3', корректируя ошибки. как получится. Это фермент, зависимый от матрицы: он добавляет только нуклеотиды, основания которых правильно спариваются с существующей цепью ДНК, действующей как матрица. Крайне важно, чтобы эти нуклеотиды имели правильную ориентацию и геометрию для пары оснований с цепью матрицы ДНК, чтобы ДНК-лигаза могла соединять различные фрагменты вместе в непрерывную цепь ДНК . Исследования полимеразы I подтвердили, что разные dNTP могут связываться с одним и тем же активным сайтом полимеразы I. Полимераза I способна активно различать разные dNTP только после того, как она претерпевает конформационные изменения . Как только это изменение произошло, Pol I проверяет правильную геометрию и правильное выравнивание пары оснований, образованной между связанным dNTP и совпадающим основанием на цепи шаблона. Правильная геометрия пар оснований A=T и G≡C — единственные, которые могут поместиться в активном сайте . Однако важно знать, что один из каждых 10 4–10 5 нуклеотидов добавлен неправильно. Тем не менее, Pol I может исправить эту ошибку в репликации ДНК, используя свой избирательный метод активной дискриминации. [5]
Несмотря на раннюю характеристику, быстро стало очевидно, что полимераза I не является ферментом, ответственным за большую часть синтеза ДНК: репликация ДНК в E. coli происходит со скоростью примерно 1000 нуклеотидов в секунду, тогда как скорость синтеза пар оснований полимеразой I в среднем составляет всего лишь 10 нуклеотидов в секунду. и 20 нуклеотидов/секунду. Более того, его клеточное содержание, составляющее примерно 400 молекул на клетку, не коррелирует с тем фактом, что у E. coli обычно имеется только две репликационные вилки . Кроме того, копирование всего генома недостаточно процессивно , поскольку он отпадает после включения всего 25–50 нуклеотидов . Его роль в репликации была доказана, когда в 1969 году Джон Кэрнс выделил жизнеспособный мутант полимеразы I , лишенный полимеразной активности. [12] Лаборантка Кэрнса, Паула Де Люсия, создала тысячи бесклеточных экстрактов из колоний E. coli и проверила их на ДНК-полимеразную активность. 3478-й клон содержал мутанта polA , которого Кэрнс назвал в честь Паулы [Де Люсии]. [13] Только после открытия ДНК-полимеразы III была наконец идентифицирована основная репликативная ДНК-полимераза.
ДНК-полимераза I, полученная из E. coli , широко используется в исследованиях в области молекулярной биологии . Однако активность экзонуклеазы 5'→3' делает его непригодным для многих применений. Эту нежелательную ферментативную активность можно просто удалить из голофермента, чтобы оставить полезную молекулу, называемую фрагментом Кленова , широко используемую в молекулярной биологии . Фактически, фрагмент Кленова использовался во время первых протоколов амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР) до тех пор, пока в 1976 году не был открыт Thermus aquaticus , источник термоустойчивой Taq - полимеразы I. [15] Воздействие ДНК-полимеразы I на протеаза субтилизин расщепляет молекулу на меньший фрагмент, который сохраняет только ДНК-полимеразную и корректирующую активность.
{{cite journal}}: Требуется цитировать журнал |journal=( помощь )