ДНК-следы — это метод исследования специфичности последовательностей ДНК -связывающих белков in vitro. Этот метод можно использовать для изучения взаимодействий белок-ДНК как снаружи, так и внутри клеток.
Регуляция транскрипции широко изучена, но многое еще остается неизвестным. Факторы транскрипции и связанные с ними белки, которые связывают промоторы , энхансеры или сайленсеры для управления или подавления транскрипции, имеют фундаментальное значение для понимания уникальной регуляции отдельных генов в геноме . Такие методы, как отслеживание ДНК, помогают выяснить, какие белки связываются с этими связанными областями ДНК, и разгадать сложности контроля транскрипции.
В 1978 году Дэвид Дж. Галас и Альберт Шмитц разработали метод отслеживания ДНК для изучения специфичности связывания белка-репрессора lac. Первоначально это была модификация метода химического секвенирования Максама-Гилберта. [1]
Простейшее применение этого метода — оценить, связывается ли данный белок с интересующей областью внутри молекулы ДНК. [2] Полимеразная цепная реакция (ПЦР) амплифицирует и метит интересующую область, которая содержит потенциальный сайт связывания белка, в идеале длина ампликона составляет от 50 до 200 пар оснований. Добавьте интересующий белок к части меченой ДНК-матрицы; часть должна оставаться отдельной без белка для последующего сравнения. Добавьте расщепляющий агент в обе части матрицы ДНК. Агент расщепления представляет собой химическое вещество или фермент, который разрезает случайные места независимо от последовательности. Реакция должна происходить достаточно долго, чтобы каждая молекула ДНК разрезалась только в одном месте. Белок, который специфически связывает участок внутри матрицы ДНК, защитит ДНК, с которой он связан, от агента расщепления. Проведите оба образца рядом с электрофорезом в полиакриламидном геле . Часть ДНК-матрицы без белка будет разрезана в случайных местах, и, таким образом, при анализе геля будет получено лестничное распределение. Матрица ДНК с белком приведет к распределению по лестнице с разрывом, «следу», где ДНК защищена от агента расщепления. Примечание. Химическое секвенирование ДНК Максама-Гилберта можно проводить вместе с образцами на полиакриламидном геле, чтобы можно было предсказать точное местоположение сайта связывания лиганда.
ДНК-матрица помечена на 3'- или 5'-конце, в зависимости от местоположения сайта(ов) связывания. Можно использовать следующие метки: радиоактивность и флуоресценция . Радиоактивность традиционно использовалась для маркировки фрагментов ДНК для анализа следов, поскольку этот метод изначально был разработан на основе метода химического секвенирования Максама-Гилберта. Радиоактивное мечение очень чувствительно и оптимально для визуализации небольших количеств ДНК. Флуоресценция является желательным достижением из-за опасности использования радиохимических веществ. Однако его было сложнее оптимизировать, поскольку он не всегда достаточно чувствителен для обнаружения низких концентраций целевых цепей ДНК, используемых в экспериментах по отслеживанию ДНК. Гели для электрофоретического секвенирования или капиллярный электрофорез оказались успешными при анализе следов флуоресцентно-меченных фрагментов. [2]
Могут быть выбраны различные расщепляющие агенты. желательным агентом является агент, нейтральный по последовательности, простой в использовании и легко контролируемый. К сожалению, ни один из доступных агентов не соответствует всем этим стандартам, поэтому подходящий агент можно выбрать в зависимости от последовательности вашей ДНК и интересующего лиганда. Подробно описаны следующие агенты расщепления: ДНКаза I представляет собой большой белок, который действует как двухцепочечная эндонуклеаза . Он связывает малую бороздку ДНК и расщепляет фосфодиэфирный остов. Это хороший агент для расщепления следов, поскольку из-за его размера его легко физически затруднить. Таким образом, с большей вероятностью его действие будет заблокировано связанным белком в последовательности ДНК. Кроме того, фермент ДНКаза I легко контролировать путем добавления ЭДТА для остановки реакции. Однако есть некоторые ограничения в использовании ДНКазы I. Фермент не разрезает ДНК случайным образом; на его активность влияют локальная структура и последовательность ДНК, и поэтому лестница получается неравномерной. Это может ограничить точность предсказания места связывания белка на молекуле ДНК. [2] [3] Гидроксильные радикалы образуются в результате реакции Фентона , которая включает восстановление Fe 2+ с помощью H 2 O 2 с образованием свободных гидроксильных молекул. Эти гидроксильные молекулы реагируют с основной цепью ДНК, что приводит к разрыву. Благодаря небольшому размеру полученный след ДНК имеет высокое разрешение. В отличие от ДНКазы I, они не зависят от последовательности и приводят к гораздо более равномерному распределению лестницы. Отрицательным аспектом использования гидроксильных радикалов является то, что их использование требует больше времени из-за более медленной реакции и времени переваривания. [4] Ультрафиолетовое облучение можно использовать для возбуждения нуклеиновых кислот и создания фотореакций, которые приводят к повреждению оснований в цепи ДНК. [5] Фотореакции могут включать в себя: разрывы одной цепи, взаимодействия между нитями ДНК или внутри них, реакции с растворителями или сшивки с белками. Рабочий процесс этого метода включает дополнительный этап: после обработки как защищенной, так и незащищенной ДНК происходит последующее удлинение праймеров расщепленных продуктов. [6] [7] Расширение прекращается при достижении поврежденного основания и, следовательно, когда продукты ПЦР прогоняются бок о бок на геле; защищенный образец покажет дополнительную полосу, где ДНК была сшита со связанным белком. Преимущества использования УФ-излучения заключаются в том, что оно реагирует очень быстро и, следовательно, может фиксировать лишь кратковременные взаимодействия. Кроме того, его можно применять in vivo.экспериментов, потому что УФ может проникать через клеточные мембраны. Недостатком является то, что гель может быть трудно интерпретировать, поскольку связанный белок не защищает ДНК, а просто изменяет фотореакции поблизости. [8]
In vivo footprinting — это метод, используемый для анализа взаимодействий белок-ДНК, которые происходят в клетке в определенный момент времени. [9] [10] ДНКаза I может использоваться в качестве расщепляющего агента, если клеточная мембрана проницаема. Однако наиболее распространенным агентом расщепления является УФ-облучение, поскольку оно проникает через клеточную мембрану, не нарушая состояния клетки, и, таким образом, может захватывать взаимодействия, чувствительные к клеточным изменениям. После того как ДНК расщеплена или повреждена УФ-излучением, клетки можно лизировать и очистить ДНК для анализа интересующей области. ПЦР с лигированием является альтернативным методом исследования in vivo . После использования агента расщепления геномной ДНК, что приводит к одноцепочечным разрывам, и ДНК изолируется, к точкам разрыва добавляется линкер. Область интереса амплифицируется между линкером и ген-специфическим праймером, и при работе на полиакриламидном геле будет оставаться след, где был связан белок. [11] In vivo footprinting в сочетании с иммунопреципитацией можно использовать для оценки специфичности белка во многих местах генома. ДНК, связанная с интересующим белком, может быть иммунопреципитирована с помощью антитела к этому белку, а затем можно оценить связывание специфической области с использованием метода ДНК-следа. [12]
Методику ДНК-следа можно модифицировать для оценки силы связывания белка с участком ДНК. Используя различные концентрации белка для эксперимента по отслеживанию следов, можно наблюдать появление следа по мере увеличения концентрации, а затем можно оценить аффинность связывания белков. [2]
Чтобы адаптировать технику следа к обновленным методам обнаружения, меченые фрагменты ДНК обнаруживаются с помощью устройства капиллярного электрофореза, а не на полиакриламидном геле. Если анализируемый фрагмент ДНК получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), к праймерам легко присоединить флуоресцентную молекулу, такую как карбоксифлуоресцеин (FAM). Таким образом, фрагменты, полученные в результате расщепления ДНКазой I, будут содержать FAM и будут обнаруживаться с помощью аппарата капиллярного электрофореза. Обычно к смеси анализируемых фрагментов также добавляют стандарты размера, меченные карбокситетраметилродамином (ROX). Таким образом были успешно идентифицированы сайты связывания транскрипционных факторов. [13]
Секвенирование нового поколения позволило использовать полногеномный подход для идентификации следов ДНК. Доказано, что открытые анализы хроматина, такие как DNase-Seq [14] и FAIRE-Seq [15], обеспечивают надежную регуляторную среду для многих типов клеток. [16] Однако эти анализы требуют некоторых последующих биоинформатических анализов, чтобы обеспечить полногеномные следы ДНК. Предлагаемые вычислительные инструменты можно разделить на два класса: подходы на основе сегментации и сайтоцентрические подходы.
Методы, основанные на сегментации, основаны на применении скрытых марковских моделей или методов скользящего окна для сегментации генома на открытую/закрытую область хроматина. Примерами таких методов являются: HINT, [17], метод Бойля [18] и метод Нефа. [19] Сайт-центрические методы, с другой стороны, находят следы с учетом профиля открытого хроматина вокруг сайтов связывания, предсказанных мотивом, т.е. регуляторных областей, предсказанных с использованием информации о последовательности ДНК-белка (закодированной в таких структурах, как матрица весов позиций ). Примерами таких методов являются Сороконожка [20] и метод Куэльяра-Партиды. [21]