stringtranslate.com

Дегидрогеназа D-аминокислот

Дегидрогеназа D-аминокислот (EC 1.4.99.1) — бактериальный фермент, катализирующий окисление D-аминокислот в соответствующие им оксокислоты . В качестве кофакторов он содержит как флавин , так и негемовое железо . [1] Фермент обладает очень широкой специфичностью и может действовать на большинство D-аминокислот. [2]

D-аминокислота + H 2 O + акцептор <=> 2-оксокислота + NH 3 + восстановленный акцептор

Эта реакция отличается от реакции окисления, катализируемой оксидазой D-аминокислот , которая использует кислород в качестве второго субстрата, поскольку дегидрогеназа может использовать множество различных соединений в качестве акцепторов электронов, при этом физиологическим субстратом является кофермент Q. [ 1] [3]

Дегидрогеназа D-аминокислот — это фермент, который катализирует NADPH из NADP+ и D-глюкозы для получения D-аминокислот и глюкозодегидрогеназы. Некоторые, но не ограничиваясь этими аминокислотами, — это D-лейцин, D-изолейцин и D-валин, которые являются незаменимыми аминокислотами, которые люди не могут синтезировать из-за того, что они не включены в их рацион. Более того, D-аминокислоты катализируют образование 2-оксокислот для получения D-аминокислот в присутствии DCIP, который является акцептором электронов. [4] D-аминокислоты используются в качестве компонентов фармацевтических продуктов, таких как антибиотики, антикоагулянты и пестициды, поскольку было показано, что они не только более эффективны, чем их L-энантиомеры, но и более устойчивы к ферментативной деградации. [5] Ферменты дегидрогеназы D-аминокислот были синтезированы с помощью мутагенеза со способностью производить прямые, разветвленные, циклические алифатические и ароматические D-аминокислоты. [5] Растворимая дегидрогеназа D-аминокислот имеет тенденцию увеличивать свое сродство к D-аланину, D-аспарагину и D -амино-н-бутирату. [6]

В E. coli K12 дегидрогеназа D-аминокислот наиболее активна с D-аланином в качестве субстрата, поскольку эта аминокислота является единственным источником углерода, азота и энергии. Фермент работает оптимально при pH 8,9 и имеет константу Михаэлиса для D-аланина, равную 30 мМ. [7] DAD, обнаруженный в грамотрицательной мембране E. coli B, может также преобразовывать L-аминокислоты в D-аминокислоты. [8]

Кроме того, дегидрогеназа D-аминокислот используется в дегидрогеназе, связанной с красителем (Dye-DHs), которая использует искусственные красители, такие как 2,6-дихлориндофенол (DCIP), в качестве акцептора электронов вместо использования их естественных акцепторов электронов. Это может ускорить реакцию между ферментом и субстратом при переносе электронов. [9]

Использование в реакциях синтеза

Дегидрогеназа D-аминокислот показала себя эффективной в синтезе аминокислот с разветвленной цепью, таких как D-лейцин, D-изолейцин и D-валин. В данном исследовании исследователи успешно использовали дегидрогеназу D-аминокислот для создания больших количеств этих продуктов из исходного материала 2-оксокислот в присутствии аммиака. Условия для этого были разными, хотя наилучшие результаты были получены при температуре около 65 °C.

Аминокислоты, полученные в результате этих реакций, показали высокую энантиоселективность >99% и высокие выходы >99%.

Учитывая природу этого фермента, его можно использовать для создания неразветвленных D-аминокислот, а также модифицированных D-аминокислот. [10]

Получение дегидрогеназы D-аминокислот

В одном исследовании, чтобы проверить жизнеспособность использования D-аминодегидрогеназы в реакциях синтеза, исследователи использовали мутантные бактерии для получения и создания различных штаммов фермента. Эти исследователи обнаружили, что для модификации селективной D-аминодегидрогеназы для работы с другими D-аминокислотами требуется всего пять мутаций. Они также обнаружили, что она сохранила свою высокоселективную природу, способную получать в основном D-энантиомеры после мутации с выходом более 95%. [5]

У бактерии Rhodothermus marinus JCM9785 обнаружен термостабильный вариант дегидрогеназы D-аминокислот. Этот вариант участвует в катаболизме транс-4-гидрокси-L-пролина. [11]

Из приведенных исследований следует, что для получения дегидрогеназы D-аминокислот необходимо сначала ввести и экспрессировать ее в пределах определенного вида бактерий, некоторые из которых ранее упоминались. Затем ее необходимо очистить в благоприятных условиях. Они основаны на конкретном виде дегидрогеназы D-аминокислот, используемом в данном исследовательском эксперименте. При неправильных условиях белок может денатурировать. Например, было обнаружено, что конкретно дегидрогеназы D-аланин из E. coli и P. aeruginosa теряют большую часть своей активности при воздействии условий 37–42 °C. После этого их можно разделить и очистить с помощью существующих методов. [12]

Искусственная дегидрогеназа D-аминокислот

Из-за недостатков современных методов исследователи начали работу по созданию искусственного фермента, способного производить те же D-аминокислоты, что и ферменты из природных источников. Добавив пять аминокислот к данному образцу, выделенному из U. thermosphaericus, они добились успеха. Модифицируя аминокислотную последовательность, исследователи смогли изменить специфичность молекулы по отношению к определенным реагентам и продуктам, показав, что можно использовать искусственную дегидрогеназу D-аминокислот для скрининга определенных продуктов D-аминокислот. [13]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab Olsiewski PJ, Kaczorowski GJ, Walsh C (25 мая 1980 г.). «Очистка и свойства дегидрогеназы D-аминокислот, индуцируемого мембраносвязанного железо-серного флавофермента из Escherichia coli B». J. Biol. Chem . 255 (10): 4487–94. doi : 10.1016/S0021-9258(19)85517-5 . PMID  6102989.
  2. ^ Tsukada K (10 октября 1966 г.). «Дегидрогеназы D-аминокислот Pseudomonas fluorescens». J. Biol. Chem . 241 (19): 4522–8. doi : 10.1016/S0021-9258(18)99750-4 . hdl : 2433/211070 . PMID  5925166.
  3. ^ Jones H, Venables WA (1983). «Влияние солюбилизации на некоторые свойства мембраносвязанного дыхательного фермента D-аминокислотной дегидрогеназы Escherichia coli». FEBS Letters . 151 (2): 189–92. doi : 10.1016/0014-5793(83)80066-0 . PMID  6131836. S2CID  26120769.
  4. ^ Акита, Хиронага; Сузуки, Хирокадзу; Дои, Кацуми; Ошима, Тосихиса (1 февраля 2014 г.). «Эффективный синтез аминокислот с d-разветвленной цепью и их меченых соединений со стабильными изотопами с использованием дегидрогеназы d-аминокислот». Прикладная микробиология и биотехнология . 98 (3): 1135–1143. doi :10.1007/s00253-013-4902-1. ISSN  1432-0614. PMID  23661083. S2CID  2640504.
  5. ^ abc Vedha-Peters, Kavitha; Gunawardana, Manjula; Rozzell, J. David; Novick, Scott J. (август 2006 г.). «Создание широкодиапазонной и высокостереоселективной аминокислотной дегидрогеназы для одношагового синтеза d-аминокислот». Журнал Американского химического общества . 128 (33): 10923–10929. doi :10.1021/ja0603960. ISSN  0002-7863. PMC 2533268. PMID 16910688  . 
  6. ^ Джонс, Х. (январь 1983 г.). «Влияние солюбилизации на некоторые свойства мембраносвязанного дыхательного фермента D-аминокислоты Escherichia coli». FEBS Letters . 151 (2): 189–192. doi : 10.1016/0014-5793(83)80066-0 . PMID  6131836. S2CID  26120769.
  7. ^ Франклин, FCH (10 января 1976 г.). «Биохимические, генетические и регуляторные исследования катаболизма аланина в Escherichia coli K12». Молекулярная и общая генетика . 149 (2): 229–237. doi :10.1007/BF00332894. PMID  13292. S2CID  22823588.
  8. ^ Сюй, Цзиньцзинь; Бай, Яцзюнь; Фань, Тайпин; Чжэн, Сяохуэй; Цай, Юйцзе (4 июля 2017 г.). «Экспрессия, очистка и характеристика мембраносвязанной дегидрогеназы d-аминокислот из Proteus mirabilis JN458». Biotechnology Letters . 39 (10): 1559–1566. doi :10.1007/s10529-017-2388-0. ISSN  0141-5492. PMID  28676939. S2CID  11335026.
  9. ^ Сатомура, Такенори; Сакураба, Харухико; Суйе, Син-Ичиро; Ошима, Тосихиса (1 ноября 2015 г.). «Связанные с красителем дегидрогеназы D-аминокислот: биохимические характеристики и применение в биотехнологии». Прикладная микробиология и биотехнология . 99 (22): 9337–9347. doi :10.1007/s00253-015-6944-z. ISSN  1432-0614. PMID  26362681. S2CID  12495865.
  10. ^ Акита, Хиронага; Сузуки, Хирокадзу; Дои, Кацуми; Ошима, Тосихиса (2013-05-10). «Эффективный синтез аминокислот с d-разветвленной цепью и их меченых соединений со стабильными изотопами с использованием дегидрогеназы d-аминокислот». Прикладная микробиология и биотехнология . 98 (3): 1135–1143. doi :10.1007/s00253-013-4902-1. ISSN  0175-7598. PMID  23661083. S2CID  2640504.
  11. ^ Сатомура, Такенори; Ишикура, Масару; Коянаги, Такаши; Сакураба, Харухико; Ошима, Тосихиса; Суйе, Син-Ичиро (2014-12-05). «Связанная с красителем дегидрогеназа d-аминокислот из термофильной бактерии Rhodothermus marinus JCM9785: характеристики и роль в катаболизме транс-4-гидрокси-L-пролина». Прикладная микробиология и биотехнология . 99 (10): 4265–4275. doi :10.1007/s00253-014-6263-9. ISSN  0175-7598. PMID  25472442. S2CID  11805375.
  12. ^ Сюй, Цзиньцзинь; Бай, Яцзюнь; Фань, Тайпин; Чжэн, Сяохуэй; Цай, Юйцзе (2017-07-04). «Экспрессия, очистка и характеристика мембраносвязанной дегидрогеназы d-аминокислот из Proteus mirabilis JN458». Biotechnology Letters . 39 (10): 1559–1566. doi :10.1007/s10529-017-2388-0. ISSN  0141-5492. PMID  28676939. S2CID  11335026.
  13. ^ Акита, Хиронага; Хаяси, Дзюндзи; Сакураба, Харухико; Ошима, Тосихиса (2018-08-03). "Искусственная термостабильная дегидрогеназа D-аминокислот: создание и применение". Frontiers in Microbiology . 9 : 1760. doi : 10.3389/fmicb.2018.01760 . ISSN  1664-302X. PMC 6085447. PMID 30123202  . 

Внешние ссылки