Криогенная электронная томография ( cryoET ) — это метод визуализации, используемый для реконструкции трехмерных объемов образцов с высоким разрешением (~1–4 нм), часто (но не ограничиваясь) биологическими макромолекулами и клетками . [1] [2] КриоЭТ — это специализированное применение просвечивающей электронной криомикроскопии (CryoTEM), в которой образцы визуализируются при их наклоне, что приводит к получению серии двухмерных изображений, которые можно объединить для создания трехмерной реконструкции, аналогичной компьютерной томографии человеческого тела. В отличие от других методов электронной томографии , образцы визуализируются в криогенных условиях (< −150 °C). Для клеточного материала структура иммобилизуется в некристаллическом стекловидном льду , что позволяет визуализировать их без дегидратации или химической фиксации , которые в противном случае нарушили бы или исказили биологические структуры. [3] [4]
В электронной микроскопии (ЭМ) образцы визуализируются в высоком вакууме . Такой вакуум несовместим с биологическими образцами, такими как клетки; вода выкипит, а разница в давлении взорвет клетку. Поэтому в методах ЭМ при комнатной температуре образцы готовятся путем фиксации и дегидратации. Однако другим подходом к стабилизации биологических образцов является их замораживание ( криоэлектронная микроскопия или криоЭМ). Как и в других методах электронной криомикроскопии, образцы для криоЭТ (обычно небольшие клетки, такие как бактерии , археи или вирусы ) готовятся в стандартных водных средах и наносятся на сетку ЭМ. Затем сетка погружается в криоген (обычно жидкий этан ) настолько эффективно, что молекулы воды не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. [3] Полученное состояние воды называется «стекловидным льдом» и сохраняет нативные клеточные структуры, такие как липидные мембраны , которые обычно разрушаются при замораживании. Образцы, замороженные методом погружения, впоследствии хранятся и обрабатываются при температуре жидкого азота , чтобы вода никогда не нагревалась достаточно для кристаллизации.
Образцы визуализируются в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ). Как и в других методах электронной томографии , образец наклоняется под разными углами относительно электронного пучка (обычно каждые 1 или 2 градуса от примерно −60° до +60°), и изображение получается под каждым углом. [5] Затем эта серия наклонных изображений может быть реконструирована с помощью вычислений в трехмерное изображение интересующего объекта. [6] Это называется томограммой или томографической реконструкцией .
Одним из наиболее часто упоминаемых преимуществ криоЭТ является возможность реконструировать трехмерные объемы отдельных объектов (белков, клеток и т. д. ) вместо необходимости создания нескольких копий образца в кристаллографических методах или других методах визуализации криоЭМ, таких как анализ отдельных частиц . [7] КриоЭТ считается методом in situ при использовании на нетронутой клетке или другой системе, поскольку замораживание погружением фиксирует образец на месте достаточно быстро, чтобы вызвать минимальные изменения в расположении атомов. [8]
В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом , образцы должны быть очень тонкими, чтобы не вызвать потемнение образцов из-за множественных событий упругого рассеяния . Поэтому в криоЭТ образцы обычно имеют толщину менее ~500 нм. По этой причине большинство исследований криоЭТ были сосредоточены на очищенных макромолекулярных комплексах , вирусах или небольших клетках, таких как клетки многих видов бактерий и архей. [1] Например, криоЭТ использовался для понимания инкапсуляции наночастиц белковой клетки размером 12 нм внутри вирусоподобных наночастиц размером 60 нм. [9]
Более крупные клетки и даже ткани можно подготовить для криоЭТ путем истончения, либо путем криосечения, либо путем измельчения сфокусированным ионным пучком (FIB). При криосечении замороженные блоки клеток или тканей разрезаются на тонкие образцы с помощью криомикротома . [11] При измельчении FIB замороженные образцы подвергаются воздействию сфокусированного пучка ионов, обычно галлия , которые точно срезают материал с верхней и нижней части образца, оставляя тонкую пластинку, подходящую для визуализации с помощью криоЭТ. [12]
Для структур, которые присутствуют в нескольких копиях на одной или нескольких томограммах, более высокое разрешение (даже ≤1 нм) может быть получено путем усреднения субтомограмм. [13] [14] Подобно анализу отдельных частиц, усреднение субтомограмм вычислительно объединяет изображения идентичных объектов для увеличения отношения сигнал/шум .
Известно, что электронная микроскопия быстро разрушает биологические образцы по сравнению с образцами в материаловедении и физике из-за радиационного повреждения . [15] В большинстве других методов, основанных на электронной микроскопии для визуализации биологических образцов, объединение сигнала от многих различных копий образца было общим способом преодоления этой проблемы ( например, кристаллография, анализ отдельных частиц). В криоЭТ вместо того, чтобы делать много изображений различных копий образца, делается много изображений одной области. Следовательно, флюенс ( количество электронов, переданных на единицу площади) на образце примерно в 2-5 раз больше, чем при анализе отдельных частиц. [16] Томография на материалах, гораздо более устойчивых, обеспечивает значительно более высокое разрешение, чем типичная биологическая визуализация, что позволяет предположить, что радиационное повреждение является наибольшим ограничением для криоЭТ биологических образцов. [7] [17]
Сильное взаимодействие электронов с веществом также приводит к эффекту анизотропного разрешения. Поскольку образец наклоняется во время получения изображения, электронный луч взаимодействует с более толстым видимым образцом вдоль оптической оси микроскопа при более высоких углах наклона. На практике углы наклона, превышающие приблизительно 60–70°, не дают много информации и поэтому не используются. Это приводит к «отсутствию клина» информации в конечной томограмме, что снижает разрешение параллельно электронному лучу. [6]
Термин «отсутствующий клин» происходит от вида преобразования Фурье томограммы, где пустой клин очевиден из-за того, что образец не наклонен на 90°. Отсутствующий клин приводит к отсутствию разрешения по глубине образца, поскольку отсутствующая информация в основном находится вдоль оси z. Отсутствующий клин также является проблемой в трехмерной электронной кристаллографии , где она обычно решается путем слияния нескольких наборов данных, которые перекрывают друг друга, или путем расширения симметрии , где это возможно. [15] Оба эти решения обусловлены природой кристаллографии, и поэтому ни одно из них не может быть применено к томографии.
Основным препятствием в криоЭТ является идентификация интересующих структур в сложных клеточных средах. Такие решения, как коррелированная криофлуоресцентная световая микроскопия [ 19] и сверхразрешающая световая микроскопия (например, крио-PALM [20] ), могут быть интегрированы с криоЭТ. В этих методах образец, содержащий интересующий флуоресцентно-меченый белок, замораживается погружением и сначала визуализируется в световом микроскопе, оснащенном специальным столиком, позволяющим поддерживать образец при температурах субкристаллизации (< −150 °C). Определяется местоположение флуоресцентного сигнала, и образец переносится в криоПЭМ, где то же самое место затем визуализируется с высоким разрешением с помощью криоЭТ.