Культура растительной ткани

Выращивание клеток в лабораторных условиях

Культура растительной ткани представляет собой набор методов, используемых для поддержания или выращивания растительных клеток, тканей или органов в стерильных условиях на питательной культуральной среде известного состава. Он широко используется для получения клонов растения методом, известным как микроразмножение . Различные методы в культуре растительной ткани могут иметь определенные преимущества по сравнению с традиционными методами размножения, включая:

Культура тканей in vitro эксплантов картофеля

Культуры растительных тканей, выращиваемые в семенном банке Министерства сельского хозяйства США , Национальном центре сохранения генетических ресурсов.

• Производство точных копий растений, которые дают особенно хорошие цветы, плоды или обладают другими желаемыми характеристиками.
• Для быстрого получения зрелых растений.
• Выращивание большого количества растений на ограниченной площади.
• Производство множества растений при отсутствии семян или необходимых опылителей для производства семян.
• Регенерация целых растений из растительных клеток, которые были генетически модифицированы.
• Выращивание растений в стерильных контейнерах позволяет перевозить их с существенно сниженной вероятностью передачи болезней, вредителей и патогенов.
• Выращивание растений из семян, которые в противном случае имеют очень низкие шансы прорасти и вырасти, например, орхидеи и непентесы .
• Очистить отдельные растения от вирусных и других инфекций и быстро размножить эти растения в качестве «очищенного материала» для садоводства и сельского хозяйства.
• Воспроизведение устойчивых растений, необходимых для восстановления земель.
• Хранение генетического растительного материала для защиты местных видов растений.

Культура растительной ткани основана на том факте, что многие части растения обладают способностью регенерировать в целое растение (клетки этих регенерирующих частей растения называются тотипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в различные специализированные клетки). Отдельные клетки, растительные клетки без клеточных стенок ( протопласты ), части листьев, стеблей или корней часто могут быть использованы для создания нового растения на питательной среде с учетом необходимых питательных веществ и фитогормонов .

Методы, используемые для культивирования растительных тканей in vitro

Подготовка растительной ткани для культивирования тканей выполняется в асептических условиях в отфильтрованном HEPA воздухе, подаваемом ламинарным шкафом . После этого ткань выращивается в стерильных контейнерах, таких как чашки Петри или колбы, в комнате для выращивания с контролируемой температурой и интенсивностью освещения. Живые растительные материалы из окружающей среды естественным образом загрязнены на своих поверхностях (а иногда и внутри) микроорганизмами , поэтому их поверхности стерилизуются в химических растворах (обычно спирте и гипохлорите натрия или кальция ) ^[1] перед взятием подходящих образцов (известных как экспланты ). Затем стерильные экспланты обычно помещают на поверхность стерильной твердой питательной среды, но иногда их помещают непосредственно в стерильную жидкую среду, особенно когда требуются культуры суспензии клеток. Твердые и жидкие среды обычно состоят из неорганических солей плюс несколько органических питательных веществ, витаминов и фитогормонов. Твердые среды готовятся из жидких сред с добавлением гелеобразующего агента, обычно очищенного агара .

Состав среды, в частности, фитогормоны и источник азота (нитрат против солей аммония или аминокислот) оказывают глубокое воздействие на морфологию тканей, которые вырастают из исходного экспланта. Например, избыток ауксина часто приводит к пролиферации корней, в то время как избыток цитокинина может дать побеги . Баланс как ауксина, так и цитокинина часто приводит к неорганизованному росту клеток или каллюсу , но морфология отростка будет зависеть от вида растения, а также от состава среды. По мере роста культур части обычно отрезают и субкультивируют на новых средах, чтобы обеспечить рост или изменить морфологию культуры. Навыки и опыт специалиста по культуре тканей важны при принятии решения о том, какие части культивировать, а какие отбросить.

По мере появления побегов в культуре их можно срезать и укоренить с помощью ауксина, чтобы получить ростки, которые после созревания можно пересадить в почву для дальнейшего выращивания в теплице как обычные растения. ^[2]

Пути регенерации

Конкретные различия в регенерационном потенциале различных органов и эксплантов имеют различные объяснения. К значимым факторам относятся различия в стадии клеток в клеточном цикле , наличие или способность транспортировать эндогенные регуляторы роста и метаболические возможности клеток. Наиболее часто используемыми эксплантатами тканей являются меристематические концы растений, такие как верхушка стебля, верхушка пазушной почки и верхушка корня. ^[3] Эти ткани имеют высокие показатели деления клеток и либо концентрируют, либо вырабатывают необходимые регулирующие рост вещества, включая ауксины и цитокинины.

Эффективность регенерации побегов в культуре тканей обычно является количественным признаком , который часто варьируется между видами растений и внутри вида растений среди подвидов, разновидностей, сортов или экотипов . Поэтому регенерация культуры тканей может стать сложной, особенно когда необходимо разработать много процедур регенерации для различных генотипов в пределах одного вида.

Три распространенных пути регенерации культуры растительных тканей — это размножение из уже существующих меристем (культура побегов или узловая культура), органогенез и незиготический эмбриогенез .

Размножение побегов или узловых сегментов обычно выполняется в четыре этапа для массового производства проростков посредством вегетативного размножения in vitro, но органогенез является стандартным методом микроразмножения, который включает регенерацию тканей придаточных органов или пазушных почек напрямую или косвенно из эксплантов. Незиготический эмбриогенез является примечательным путем развития, который весьма сопоставим с таковым зиготических эмбрионов, и это важный путь для получения сомаклональных вариантов, разработки искусственных семян и синтеза метаболитов. Из-за одноклеточного происхождения незиготических эмбрионов они предпочтительны в нескольких системах регенерации для микроразмножения, манипуляции плоидностью, переноса генов и производства синтетических семян. Тем не менее, регенерация тканей посредством органогенеза также оказалась выгодной для изучения регуляторных механизмов развития растений.

Выбор экспланта

Ткань, полученная от растения для культивирования, называется эксплантатом.

Экспланты можно брать из многих различных частей растения, включая части побегов, листьев, стеблей, цветов, корней, отдельных недифференцированных клеток и из многих типов зрелых клеток, при условии, что они все еще содержат живую цитоплазму и ядра и способны дедифференцироваться и возобновлять деление клеток. Это привело к появлению концепции тотипотентности растительных клеток. ^{[4] [5]} Однако это не относится ко всем клеткам или ко всем растениям. ^[6] У многих видов экспланты различных органов различаются по скорости роста и регенерации, а некоторые вообще не растут. Выбор материала экспланта также определяет, будут ли проростки, полученные с помощью культуры тканей, гаплоидными или диплоидными . Кроме того, риск микробного заражения увеличивается при использовании неподходящих эксплантатов.

Первый метод, включающий меристемы и индукцию множественных побегов, является предпочтительным методом для индустрии микроразмножения, поскольку риски сомаклональной изменчивости (генетической изменчивости, индуцированной в культуре тканей) минимальны по сравнению с двумя другими методами. Соматический эмбриогенез — это метод, который потенциально может быть в несколько раз выше в скорости размножения и поддается обработке в системах жидкой культуры, таких как биореакторы.

Некоторые экспланты, такие как кончик корня , трудно изолировать, и они загрязнены почвенной микрофлорой, которая становится проблематичной в процессе культивирования тканей. Определенная почвенная микрофлора может образовывать тесные связи с корневой системой или даже расти внутри корня. Частицы почвы, связанные с корнями, трудно удалить, не повредив корни, что затем допускает микробную атаку. Эта связанная микрофлора , как правило, перерастает среду культивирования тканей до того, как произойдет значительный рост растительной ткани.

Некоторые культивируемые ткани растут медленно. Для них есть два варианта: (i) Оптимизация питательной среды; (ii) Культивирование высокочувствительных тканей или сортов. ^[7] Некроз может испортить культивируемые ткани. Как правило, сорта растений различаются по восприимчивости к некрозу тканевой культуры. Таким образом, культивируя высокочувствительные сорта (или ткани), его можно контролировать. ^[7]

Воздушные (надпочвенные) экспланты также богаты нежелательной микрофлорой. Однако их легче удалить с экспланта путем осторожного промывания, а остаток обычно можно убить путем поверхностной стерилизации. Большая часть поверхностной микрофлоры не образует тесных связей с растительной тканью . Такие связи обычно можно обнаружить при визуальном осмотре в виде мозаики, обесцвечивания или локализованного некроза на поверхности экспланта.

Альтернативой получения незараженных эксплантов является взятие эксплантов из саженцев, выращенных асептически из поверхностно-стерилизованных семян. Твердая поверхность семян менее проницаема для проникновения агрессивных поверхностно-стерилизующих агентов, таких как гипохлорит , поэтому приемлемые условия стерилизации, используемые для семян, могут быть гораздо более строгими, чем для вегетативных тканей.

Растения, выращенные из тканей, являются клонами . Если исходное материнское растение, использованное для получения первых эксплантов, восприимчиво к патогену или условиям окружающей среды, весь урожай будет восприимчив к той же проблеме. И наоборот, любые положительные черты также останутся в пределах линии.

Применение культуры растительных тканей

Культура растительных тканей широко используется в растениеводстве, лесном хозяйстве и садоводстве. Области применения включают:

• Коммерческое производство растений, используемых в качестве горшечных культур, объектов ландшафтного дизайна и флористики, при котором используется культура меристемы и побегов для получения большого количества идентичных особей. ^[8]
• Сохранять редкие или находящиеся под угрозой исчезновения виды растений. ^{[9] [10]}
• Селекционер растений может использовать культуру тканей для скрининга клеток, а не растений, на предмет наличия полезных признаков, например, устойчивости/толерантности к гербицидам , обнаружения химер на ранней стадии развития. ^[11]
• Крупномасштабное выращивание растительных клеток в жидкой культуре в биореакторах для производства ценных соединений, таких как вторичные метаболиты растительного происхождения и рекомбинантные белки, используемые в качестве биофармацевтических препаратов . ^[12]
• Скрещивание отдаленно родственных видов путем слияния протопластов и регенерации нового гибрида .
• Быстро изучить молекулярную основу физиологических, биохимических и репродуктивных механизмов растений, например, in vitro селекцию растений, устойчивых к стрессу. ^[13]
• Перекрестное опыление отдаленно родственных видов и последующее культивирование тканей полученного эмбриона, который в противном случае погиб бы (спасение эмбрионов).
• Для удвоения хромосом и индукции полиплоидии , ^[14] например, удвоенные гаплоиды, тетраплоиды и другие формы полиплоидов . Обычно это достигается применением антимитотических агентов, таких как колхицин или оризалин .
• В качестве ткани для трансформации с последующим либо краткосрочным тестированием генетических конструкций, либо регенерацией трансгенных растений.
• Определенные методы, такие как культивирование кончиков меристемы, можно использовать для получения чистого растительного материала из зараженного вирусом сырья, например, сахарного тростника, ^[15] картофеля и многих видов мягких фруктов.
• Возможно получение идентичных стерильных гибридных видов.
• Крупномасштабное производство искусственных семян посредством соматического эмбриогенеза ^{[16] [17]}

Примеры

Развитие сомаклональных вариаций

Устойчивость к изменению климата

- Как в Kaveri Vaman (от NRCB, Тамил Наду), мутант банана, выращенный на тканевой культуре, способный выдерживать сильные дожди. ^[18]

Продукция вторичных метаболитов

- Например, кофеин из coffea arabica , никотин из Nicotiana rustica или фенольные кислоты из Echinacea purpurea . ^[19]

Индукция цветения

- У деревьев с задержкой цветения или бамбука - некоторые виды цветут один раз в жизни, но могут жить дольше 50 лет. ^[20]

Смотрите также

• Культура волосатых корней
• Готлиб Хаберландт , пионер культуры растительных тканей
• Фредерик Кэмпион Стюард , пионер и «чемпион» культуры растительных тканей
• Среда Мурасиге и Скуга и раствор Хогланда , важные среды для роста растений
• Физиология растений

Ссылки

Примечания

1. Sathyanarayana, BN (2007). Культура растительных тканей: практики и новые экспериментальные протоколы. IK International. стр. 106–. ISBN 978-81-89866-11-2.
2. Бходжвани, СС; Раздан, МК (1996). Культура растительных тканей: теория и практика (пересмотренное издание). Elsevier. ISBN 978-0-444-81623-8.
3. Sarkar, Snehasish; Roy, Souri; Ghosh, Sudip K.; Basu, Asitava (1 апреля 2019 г.). «Применение бокового ветвления для преодоления неподатливости регенерации in vitro голубиного гороха, инфицированного Agrobacterium (Cajanus cajan L.)». Plant Cell, Tissue and Organ Culture . 137 (1): 23–32. doi :10.1007/s11240-018-01547-6. ISSN  1573-5044.
4. Васил, IK; Васил, V. (1972). «Тотипотентность и эмбриогенез в культурах растительных клеток и тканей». In Vitro . 8 (3): 117–125. doi :10.1007/BF02619487. PMID  4568172. S2CID  20181898.
5. Брайан Джеймс Этвелл; Колин Г. Н. Тернбулл; Пол Э. Кридеманн (1999). Растения в действии: адаптация в природе, производительность в выращивании (1-е изд.). Архивировано из оригинала 27 марта 2018 г. Получено 7 мая 2020 г.
6. Индра К. Васил; Тревор А. Торп (1994). Растительная клетка и культура тканей. Springer. стр. 4–. ISBN 978-0-7923-2493-5.
7. Pazuki, Arman & Sohani, Mehdi (2013). «Фенотипическая оценка каллюсов, полученных из щитка, в сортах риса 'Indica'» (PDF) . Acta Agriculturae Slovenica . 101 (2): 239–247. doi : 10.2478/acas-2013-0020 .
8. Lema-Rumińska J., Kulus D., 2014. Микроразмножение кактусов – обзор. Haseltonia 19: 46-63
9. Мукунд Р. Шукла; А. Максвелл П. Джонс; Дж. Алан Салливан; Чуньчжао Лю; Сьюзан Гослинг; Правин К. Саксена (апрель 2012 г.). «Консервация американского вяза ( Ulmus americana ) in vitro: потенциальная роль метаболизма ауксина в устойчивой пролиферации растений». Канадский журнал лесных исследований . 42 (4): 686–697. doi :10.1139/x2012-022.
10. Кулус Д., Абратовска А., 2017. КРИОконсервация Ajania pacifica (Nakai) Bremer et Humphries с помощью техники инкапсуляции-дегидратации. CryoLetters 38(5): 387-398(12)
11. Miler N., Kulus D., Sliwinska E., 2020. Содержание ядерной ДНК как показатель стабильности цвета соцветий in vitro размноженных твердых и химерных мутантов хризантемы. Plant Cell Tissue and Organ Culture 143: 421-430. https://doi.org/10.1007/s11240-020-01929-9
12. Георгиев, Милен И.; Вебер, Йост; Мацюк, Александр (2009). «Биообработка культур растительных клеток для массового производства целевых соединений». Прикладная микробиология и биотехнология . 83 (5): 809–23. doi :10.1007/s00253-009-2049-x. PMID  19488748. S2CID  30677496.
13. Манодж К. Рай; Раджвант К. Калия; Рохтас Сингх; Ману П. Гангола; АК Дхаван (апрель 2011 г.). «Развитие стрессоустойчивых растений посредством селекции in vitro — обзор последних достижений». Environmental and Experimental Botany . 71 (1): 89–98. doi :10.1016/j.envexpbot.2010.10.021.
14. Aina, O; Quesenberry, K.; Gallo, M (2012). «In vitro индукция тетраплоидов у Arachis paraguariensis ». Plant Cell, Tissue and Organ Culture . 111 (2): 231–238. doi :10.1007/s11240-012-0191-0. S2CID  9211804.
15. Pawar, KR, Waghmare, SG, Tabe, R., Patil, A. и Ambavane, AR 2017. In vitro регенерация Saccharum officinarum var. Co 92005 с использованием экспланта верхушки побега. Международный журнал науки и природы 8(1): 154-157.
16. Waghmare, SG, Pawar, KR, и Tabe, R. 2017. Соматический эмбриогенез у клубники (Fragaria ananassa) var. Camarosa. Global Journal of Bioscience and Biotechnology 6(2): 309 - 313.
17. Кулус Д., 2019. Применение синтетических семян при размножении, хранении и криоконсервации видов растений семейства астровых, [w:] Регенерация зародышевой плазмы синтетических семян, сохранение и перспективы, ред. Фейсал А., Алатар А., Springer Science & Business Media, Нидерланды, стр. 155-179. ISBN 978-3-030-24630-3, ISBN 978-3-030-24631-0 (электронная книга), https://doi.org/10.1007/978-3-030-24631-0_6
18. Бюро, The Hindu (21.08.2023). "Тиручи". The Hindu . ISSN  0971-751X . Получено 31.08.2023 . {{cite news}}: |last=имеет общее название ( помощь )
19. Lema-Rumińska J., Kulus D., Tymoszuk A., Varejão JMTB, Bahcevanziev K., 2019. Профиль вторичных метаболитов и анализ генетической стабильности в новых линиях Echinacea purpurea (L.) Moench, микроразмноженных через соматический эмбриогенез. Industrial Crops and Products 142: 111851. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2019.111851
20. Шривастава, С.; Нарула, А. (2006-01-16). Биотехнология растений и молекулярные маркеры. Springer Science & Business Media. ISBN 978-1-4020-3213-4.

Источники

• Джордж, Эдвин Ф.; Холл, Майкл А.; Де Клерк, Герт-Ян, ред. (2008). Размножение растений с помощью культуры тканей. Том 1. Предыстория (3-е изд.). Springer. ISBN 978-1-4020-5004-6.
• Ядав, Р.; Арора, П.; Кумар, Д.; Катьял, Д.; Дилбаги, Н.; Чаудхури, А. (2009). «Высокочастотная прямая регенерация растений из листьев, междоузлий и корневых сегментов восточного тополя ( Populus deltoides )». Plant Biotechnology Reports . 3 (3): 175–182. doi :10.1007/s11816-009-0088-5. S2CID  42796629.
• Сингх, СК; Шривастава, С. (2006). Культура растительных тканей. Campus Book International. ISBN 978-81-8030-123-0.