Анализ MTT представляет собой колориметрический анализ для оценки метаболической активности клеток. [1] [2] Ферменты клеточной оксидоредуктазы, зависимые от НАД(Ф)Н, могут при определенных условиях отражать количество присутствующих жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель MTT, который химически представляет собой 3-(4,5 - диметилтиазол - 2-ил)-2,5- дифенилтетразолийбромид , до его нерастворимого формазана , имеющего фиолетовый цвет. Другие близкородственные тетразолиевые красители, включая XTT, MTS и WST, используются в сочетании с промежуточным акцептором электронов, 1-метоксифеназинметосульфатом (PMS). С WST-1, который непроницаем для клеток, восстановление происходит вне клетки посредством переноса электронов через плазматическую мембрану. [3] Однако это традиционно предполагаемое объяснение в настоящее время оспаривается, поскольку также было найдено доказательство восстановления МТТ до формазана в липидных клеточных структурах без явного участия оксидоредуктаз. [4]
Анализы с тетразолиевым красителем также можно использовать для измерения цитотоксичности (потери жизнеспособных клеток) или цитостатической активности (перехода от пролиферации к покою) потенциальных лекарственных средств и токсичных материалов. Анализы МТТ обычно проводятся в темноте, поскольку реагент МТТ чувствителен к свету. [5] [6] [7]
МТТ , желтый тетразол , восстанавливается до фиолетового формазана в живых клетках. [8] Раствор для солюбилизации (обычно либо диметилсульфоксид , подкисленный раствор этанола, либо раствор детергента додецилсульфата натрия в разбавленной соляной кислоте ) добавляется для растворения нерастворимого фиолетового продукта формазана в окрашенном растворе. Поглощение этого окрашенного раствора можно количественно определить путем измерения на определенной длине волны (обычно между 500 и 600 нм) с помощью спектрофотометра . Степень поглощения света зависит от степени концентрации формазана, накопленного внутри клетки и на поверхности клетки. Чем больше концентрация формазана, тем глубже фиолетовый цвет и, следовательно, выше поглощение.
XTT (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид) был предложен для замены MTT, что обеспечивает более высокую чувствительность и более высокий динамический диапазон. Образованный краситель формазан растворим в воде, что позволяет избежать конечной стадии солюбилизации. [9]
Водорастворимые соли тетразолия являются более поздней альтернативой МТТ: они были разработаны путем введения положительных или отрицательных зарядов и гидроксильных групп в фенильное кольцо соли тетразолия или, что лучше, с помощью сульфонатных групп, добавленных напрямую или косвенно в фенильное кольцо.
MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий) в присутствии феназинметосульфата ( PMS ) производит формазановый продукт, который имеет максимум поглощения при 490 нм в фосфатно-солевом буфере. Анализ MTS часто описывается как «одношаговый» анализ MTT, который обеспечивает удобство добавления реагента непосредственно в клеточную культуру без промежуточных этапов, требуемых в анализе MTT. Однако это удобство делает анализ MTS восприимчивым к колориметрическим помехам, поскольку промежуточные этапы в анализе MTT удаляют следы окрашенных соединений, в то время как они остаются в микротитровальном планшете в одношаговом анализе MTS. Меры предосторожности необходимы для обеспечения точности при использовании этого анализа, и существуют веские аргументы в пользу подтверждения результатов MTS с помощью качественных наблюдений под микроскопом. (Однако это целесообразно для всех колориметрических анализов.) [10]
WST (водорастворимые соли тетразолия) представляют собой ряд других водорастворимых красителей для анализов MTT, разработанных для получения различных спектров поглощения образующихся формазанов. [11] WST-1 и, в частности, WST-8 (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолий) имеют преимущество перед MTT в том, что они восстанавливаются вне клеток, в сочетании с электронным медиатором PMS и дают водорастворимый формазан. Наконец, анализы WST (1) можно считывать напрямую (в отличие от MTT, которому требуется этап солюбилизации), (2) дают более эффективный сигнал, чем MTT, и (3) снижают токсичность для клеток (в отличие от проницаемого для клеток MTT и его нерастворимого формазана, который накапливается внутри клеток). [11]
Обычно предполагается, что восстановление тетразолиевого красителя зависит от ферментов оксидоредуктазы, зависящих от НАД(Ф)Н, в основном в цитозольном компартменте клетки. [3] [12] Следовательно, восстановление МТТ и других тетразолиевых красителей зависит от клеточной метаболической активности из-за потока НАД(Ф)Н. Клетки с низким метаболизмом, такие как тимоциты и спленоциты, восстанавливают очень мало МТТ. Напротив, быстро делящиеся клетки демонстрируют высокие показатели восстановления МТТ. Важно помнить, что условия анализа могут изменять метаболическую активность и, таким образом, восстановление тетразолиевого красителя, не влияя на жизнеспособность клеток. [13] Кроме того, механизм восстановления тетразолиевых красителей, т. е. внутриклеточный (МТТ, МТС) по сравнению с внеклеточным (WST-1), также будет определять количество продукта. Кроме того, были предоставлены доказательства спонтанного восстановления МТТ в липидных клеточных компартментах/структурах без участия ферментативного катализа. [4] Тем не менее, даже в рамках этой альтернативной парадигмы анализ МТТ по-прежнему оценивает восстановительный потенциал клетки (т.е. доступность восстанавливающих соединений для управления энергетикой клетки). [2] Таким образом, окончательная интерпретация жизнеспособности клетки остается неизменной.
При изучении жизнеспособности клеток, посеянных на 3D-волокнистых каркасах, толщина каркасов может влиять на результаты анализа МТТ. [14]
Оптическая плотность (ОП) при 550 нм используется для расчета процента результатов жизнеспособности с использованием следующего уравнения: [15]
где: