stringtranslate.com

Малатдегидрогеназа

Малатдегидрогеназа ( EC 1.1.1.37) ( MDH ) — фермент , который обратимо катализирует окисление малата в оксалоацетат, используя восстановление NAD + до NADH. Эта реакция является частью многих метаболических путей , включая цикл лимонной кислоты . Другие малатдегидрогеназы , которые имеют другие номера EC и катализируют другие реакции, окисляющие малат, имеют квалифицированные названия, такие как малатдегидрогеназа (NADP + ) .

Изоферменты

Существует несколько изоферментов малатдегидрогеназы. В эукариотических клетках есть две основные изоформы . [1] Одна находится в митохондриальном матриксе, участвуя в качестве ключевого фермента в цикле лимонной кислоты, который катализирует окисление малата. Другая находится в цитоплазме , помогая челноку малат-аспартат обмениваться восстановительными эквивалентами, так что малат может проходить через митохондриальную мембрану и превращаться в оксалоацетат для дальнейших клеточных процессов. [2]

У людей и большинства других млекопитающих экспрессируются следующие две малатдегидрогеназы:

Семейства белков

3-D кристаллическая структура подвижной петлевой области в малатдегидрогеназе в закрытой и открытой конформации. Закрытая конформация MDH показана розовым цветом (обозначена розовой стрелкой), а открытая конформация показана голубым цветом (обозначена голубой стрелкой).

Семейство малатдегидрогеназ содержит L-лактатдегидрогеназу и L-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназы. L-лактатдегидрогеназы катализируют превращение L-лактата в пируват , последний шаг в анаэробном гликолизе. N-конец представляет собой складку Россманна NAD-связывания, а C-конец представляет собой необычную альфа+бета-складку. [3] [4]

Эволюция и структура

В большинстве организмов малатдегидрогеназа (МДГ) существует в виде гомодимерной молекулы и по структуре тесно связана с лактатдегидрогеназой (ЛДГ). Это большая белковая молекула с субъединицами массой от 30 до 35 кДа. [5] На основании аминокислотных последовательностей кажется, что МДГ разделилась на две основные филогенетические группы, которые очень похожи либо на митохондриальные изоферменты, либо на цитоплазматические/хлоропластные изоферменты. [6] Поскольку идентичность последовательности малатдегидрогеназы в митохондриях более тесно связана с ее прокариотическими предками по сравнению с цитоплазматическим изоферментом, теория о том, что митохондрии и хлоропласты развились посредством эндосимбиоза, является правдоподобной. [7] Аминокислотные последовательности архейной МДГ больше похожи на последовательности ЛДГ, чем на МДГ других организмов. Это указывает на то, что существует возможная эволюционная связь между лактатдегидрогеназой и малатдегидрогеназой. [8]

Каждая субъединица димера малатдегидрогеназы имеет два отдельных домена, которые различаются по структуре и функциональности. Параллельная структура β-слоя составляет домен связывания NAD+, в то время как четыре β-слоя и одна α-спираль составляют центральный сайт связывания NAD + . Субъединицы удерживаются вместе посредством обширных водородных связей и гидрофобных взаимодействий. [9]

Было также показано, что малатдегидрогеназа имеет подвижную петлевую область, которая играет решающую роль в каталитической активности фермента. Исследования показали, что конформационное изменение этой петлевой области из открытой конформации в закрытую конформацию после связывания субстрата усиливает катализ MDH посредством экранирования субстрата и каталитических аминокислот от растворителя. Исследования также показали, что эта петлевая область высококонсервативна в малатдегидрогеназе. [6]

Механизм

Активный центр малатдегидрогеназы

Активный сайт малатдегидрогеназы представляет собой гидрофобную полость внутри белкового комплекса, которая имеет специфические сайты связывания для субстрата и его кофермента , НАД + . В своем активном состоянии MDH претерпевает конформационное изменение, которое охватывает субстрат, чтобы минимизировать воздействие растворителя и расположить ключевые остатки ближе к субстрату. [6] Три остатка, в частности, которые составляют каталитическую триаду, это гистидин (His-195), аспартат (Asp-168), оба из которых работают вместе как система переноса протонов, и аргинины (Arg-102, Arg-109, Arg-171), которые защищают субстрат. [10]

Механистически малатдегидрогеназа катализирует окисление гидроксильной группы малата, используя NAD + в качестве акцептора электронов. Этот этап окисления приводит к удалению протона и гидрид-иона из субстрата. NAD + получает гидрид-ион (в частности, гидрид-ион переносится на никотинамидное кольцо NAD + ) и восстанавливается до NADH, в то время как одновременно остаток His-195 на ферменте принимает протон. [11] Положительно заряженный остаток His-195, который участвует в основном катализе субстрата, стабилизируется соседним отрицательно заряженным остатком Asp-168. Эта электростатическая стабилизация помогает облегчить перенос протона. [1] Arg-102, Arg-109 и Arg-171 (которые протонированы и, таким образом, положительно заряжены) участвуют в электростатическом катализе и помогают связывать отрицательно заряженные карбоксилаты на субстрате. Кроме того, остатки аргинина на ферменте обеспечивают дополнительную субстратную специфичность и связывание посредством водородных связей между боковой цепью гуанидиния аминокислотных остатков аргинина и карбоксилатами субстрата. [12]

Исследования также выявили подвижную петлю в малатдегидрогеназе, которая участвует в каталитической активности фермента. Петля претерпевает конформационное изменение, чтобы защитить субстрат и каталитические аминокислоты от растворителя в ответ на связывание комплекса малатдегидрогеназа: кофермент с субстратом. Этот переворот петли в верхнее положение, чтобы закрыть активный сайт, также способствует усилению взаимодействия каталитически важных аминокислотных остатков на ферменте с субстратом. Кроме того, было показано, что движение петли коррелирует с этапом определения скорости фермента. [13]

Функция

Реакция

Общая реакция, показывающая, что малатдегидрогеназа катализирует окисление малата посредством восстановления НАД + .

Малатдегидрогеназа катализирует взаимопревращение малата в оксалоацетат. В цикле лимонной кислоты малатдегидрогеназа отвечает за катализ регенерации оксалоацетата. Эта реакция происходит посредством окисления гидроксильной группы на малате и восстановления НАД + . Механизм переноса гидрид-иона на НАД + осуществляется по аналогичному механизму, наблюдаемому в лактатдегидрогеназе и алкогольдегидрогеназе. ΔG'° малатдегидрогеназы составляет +29,7 кДж/моль, а ΔG (в клетке) составляет 0 кДж/моль. [11]

Другие пути

Малатдегидрогеназа также участвует в глюконеогенезе , синтезе глюкозы из более мелких молекул. Пируват в митохондриях подвергается воздействию пируваткарбоксилазы с образованием оксалоацетата, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты . Чтобы вывести оксалоацетат из митохондрий, малатдегидрогеназа восстанавливает его до малата, и затем он проходит через внутреннюю митохондриальную мембрану. Попав в цитозоль, малат окисляется обратно до оксалоацетата цитозольной малатдегидрогеназой. Наконец, фосфоенолпируваткарбоксикиназа (PEPCK) превращает оксалоацетат в фосфоенолпируват (PEP). [14]

Кинетика

Кинетические исследования показывают, что ферментативная активность малатдегидрогеназы упорядочена. Кофактор NAD + /NADH связывается с ферментом до субстрата. [15] Значение Km для малата, т.е. концентрация, при которой активность фермента составляет половину максимальной, составляет 2 мМ. Значение Kcat составляет 259,2 с −1 . [16]

Влияние pH на каталитическую активность

Кроме того, уровни pH контролируют специфичность связывания субстрата малатдегидрогеназой из-за переноса протона в каталитическом механизме. [17] Было высказано предположение, что гистидиновый фрагмент со значением pK 7,5 играет роль в зависимости фермента от pH. Исследования показали, что связывание енольной формы оксалоацетата с комплексом малатдегидрогеназа:NADH образуется гораздо быстрее при более высоких значениях pH. [12] Кроме того, связывание L-малата с малатдегидрогеназой усиливается в щелочных условиях. Следовательно, непротонированная форма малатдегидрогеназы связывается преимущественно с L-малатом и енольной формой оксалоацетата. Напротив, было обнаружено, что D-малат, гидроксималонат и кето-форма оксалоацетата связываются исключительно с протонированной формой фермента. В частности, когда гистидин протонирован, остаток His может образовывать водородную связь с карбонильным кислородом субстрата, что смещает электронную плотность от кислорода и делает его более восприимчивым к нуклеофильной атаке гидрида. Это способствует связыванию малатдегидрогеназы с этими субстратами. В результате при более низких значениях pH малатдегидрогеназа связывается преимущественно с D-малатом, гидроксималонатом и кето-оксалоацетатом. [18]

Аллостерическая регуляция

Поскольку малатдегидрогеназа тесно связана с циклом лимонной кислоты, исследования предположили и экспериментально продемонстрировали, что цитрат является аллостерическим регулятором малатдегидрогеназы в зависимости от концентраций L-малата и НАД + . Это может быть связано с отклонениями, наблюдаемыми в кинетическом поведении малатдегидрогеназы при высоких концентрациях оксалоацетата и L-малата. Эксперименты показали, что цитрат может как аллостерически активировать, так и ингибировать ферментативную активность малатдегидрогеназы. Было показано, что цитрат ингибирует окисление L-малата при низких уровнях L-малата и НАД + . Однако в присутствии высоких уровней малата и НАД + цитрат может стимулировать выработку оксалоацетата. Хотя малатдегидрогеназа обычно считается обратимым ферментом, считается, что на ферменте есть аллостерический регуляторный участок, с которым цитрат может связываться и направлять равновесие реакции в любом направлении. [19]

Также было показано, что глутамат ингибирует активность малатдегидрогеназы. Кроме того, было показано, что альфа-кетоглутаратдегидрогеназа может взаимодействовать с митохондриальной аспартатаминотрансферазой, образуя комплекс, который затем может связываться с малатдегидрогеназой, образуя тройной комплекс, который отменяет ингибирующее действие глутамата на ферментативную активность малатдегидрогеназы. Кроме того, образование этого комплекса позволяет глутамату реагировать с аминотрансферазой, не мешая активности малатдегидрогеназы. Образование этого тройного комплекса также облегчает высвобождение оксалоацетата из малатдегидрогеназы в аминотрансферазу. Кинетически, было показано, что связывание малатдегидрогеназы с бинарным комплексом альфа-кетоглутаратдегидрогеназы и аминотрансферазы увеличивает скорость реакции малатдегидрогеназы, поскольку Km малатдегидрогеназы уменьшается, когда она связана как часть этого комплекса. [20]

Интерактивная карта маршрутов

Нажмите на гены, белки и метаболиты ниже, чтобы перейти к соответствующим статьям. [§ 1]

  1. ^ Интерактивную карту путей можно редактировать на WikiPathways: «GlycolysisGluconeogenesis_WP534».

Ссылки

  1. ^ ab Минарик П., Томаскова Н., Колларова М., Анталик М. (сентябрь 2002 г.). «Малатдегидрогеназы - структура и функции». Общая физиология и биофизика . 21 (3): 257–65. ПМИД  12537350.
  2. ^ Мусрати Р.А., Колларова М, Мерник Н, Микуласова Д (сентябрь 1998 г.). «Малатдегидрогеназа: распространение, функции и свойства». Общая физиология и биофизика . 17 (3): 193–210. ПМИД  9834842.
  3. ^ Chapman AD, Cortés A, Dafforn TR, Clarke AR, Brady RL (январь 1999). «Структурная основа субстратной специфичности малатдегидрогеназ: кристаллическая структура тройного комплекса цитоплазматической малатдегидрогеназы свиньи, альфа-кетомалоната и тетрагидроНАД». Журнал молекулярной биологии . 285 (2): 703–12. doi : 10.1006/jmbi.1998.2357 . PMID  10075524.
  4. ^ Madern D (июнь 2002 г.). «Молекулярная эволюция в суперсемействе L-малат и L-лактатдегидрогеназ». Журнал молекулярной эволюции . 54 (6): 825–40. Bibcode : 2002JMolE..54..825M. doi : 10.1007/s00239-001-0088-8. PMID  12029364. S2CID  469660.
  5. ^ Banaszak LJ, Bradshaw RA (1975). «Малатдегидрогеназа». В Boyer PD (ред.). The Enzymes . Т. 11 (3-е изд.). Нью-Йорк: Academic Press. С. 369–396.
  6. ^ abc Goward CR, Nicholls DJ (октябрь 1994 г.). «Малатдегидрогеназа: модель структуры, эволюции и катализа». Protein Science . 3 (10): 1883–8. doi :10.1002/pro.5560031027. PMC 2142602 . PMID  7849603. 
  7. ^ McAlister-Henn L (май 1988). «Эволюционные отношения между малатдегидрогеназами». Trends in Biochemical Sciences . 13 (5): 178–81. doi :10.1016/0968-0004(88)90146-6. PMID  3076279.
  8. ^ Cendrin F, Chroboczek J, Zaccai G, Eisenberg H, Mevarech M (апрель 1993 г.). «Клонирование, секвенирование и экспрессия в Escherichia coli гена, кодирующего малатдегидрогеназу чрезвычайно галофильной архебактерии Haloarcula marismortui». Биохимия . 32 (16): 4308–13. doi :10.1021/bi00067a020. PMID  8476859.
  9. ^ Холл МД, Левитт ДГ, Банашак ЛДЖ (август 1992 г.). «Кристаллическая структура малатдегидрогеназы Escherichia coli. Комплекс апофермента и цитрата при разрешении 1,87 А». Журнал молекулярной биологии . 226 (3): 867–82. doi :10.1016/0022-2836(92)90637-Y. PMID  1507230.
  10. ^ Ламзин ВС, Даутер З, Уилсон КС (май 1994). «Дегидрогенизация через зеркало». Nature Structural Biology . 1 (5): 281–2. doi :10.1038/nsb0594-281. PMID  7664032. S2CID  26167967.
  11. ^ ab Voet D, Voet JG, Pratt CW (2015). Основы биохимии: жизнь на молекулярном уровне (4-е изд.). Хобокен, Нью-Джерси: Wiley. стр. 574–5. ISBN 978-0-470-54784-7.
  12. ^ ab Bernstein LH, Everse J (декабрь 1978 г.). "Исследования механизма реакции малатдегидрогеназы" (PDF) . Журнал биологической химии . 253 (24): 8702–7. doi : 10.1016/S0021-9258(17)34234-5 . PMID  31361.
  13. ^ Waldman AD, Hart KW, Clarke AR, Wigley DB, Barstow DA, Atkinson T, Chia WN, Holbrook JJ (январь 1988 г.). «Использование генетически модифицированного триптофана для идентификации движения домена лактатдегидрогеназы B. stearothermophilus с помощью процесса, который ограничивает стационарный оборот фермента». Biochemical and Biophysical Research Communications . 150 (2): 752–9. doi :10.1016/0006-291X(88)90455-X. PMID  3422557.
  14. ^ Hung GC, Brown CR, Wolfe AB, Liu J, Chiang HL (ноябрь 2004 г.). «Деградация глюконеогенных ферментов фруктозо-1,6-бисфосфатазы и малатдегидрогеназы опосредуется различными протеолитическими путями и сигнальными событиями». Журнал биологической химии . 279 (47): 49138–50. doi : 10.1074/jbc.M404544200 . PMID  15358789.
  15. ^ Показывает TB, Chapman VM, Ruddle FH (декабрь 1970 г.). «Митохондриальная малатдегидрогеназа и яблочный фермент: унаследованные менделевские электрофоретические варианты у мышей». Biochemical Genetics . 4 (6): 707–18. doi :10.1007/BF00486384. PMID  5496232. S2CID  35435579.
  16. ^ Wood DC, Jurgensen SR, Geesin JC, Harrison JH (март 1981). «Взаимодействия субъединиц в митохондриальной малатдегидрогеназе. Кинетика и механизм реассоциации». Журнал биологической химии . 256 (5): 2377–82. doi : 10.1016/S0021-9258(19)69790-5 . PMID  7462244.
  17. ^ Dasika SK, Vinnakota KC, Beard DA (январь 2015 г.). «Определение каталитического механизма митохондриальной малатдегидрогеназы». Biophysical Journal . 108 (2): 408–19. doi :10.1016/j.bpj.2014.11.3467. PMC 4302198 . PMID  25606688. 
  18. ^ Lodola A, Shore JD, Parker DM, Holbrook J (декабрь 1978 г.). «Малатдегидрогеназа цитозоля. Кинетическое исследование механизма реакции и сравнение с лактатдегидрогеназой». The Biochemical Journal . 175 (3): 987–98. doi :10.1042/bj1750987. PMC 1186162. PMID  217361 . 
  19. ^ Gelpí JL, Dordal A, Montserrat J, Mazo A, Cortés A (апрель 1992 г.). «Кинетические исследования регуляции митохондриальной малатдегидрогеназы цитратом». The Biochemical Journal . 283 (Pt 1) (Pt 1): 289–97. doi : 10.1042/bj2830289. PMC 1131027. PMID  1567375. 
  20. ^ Fahien LA, Kmiotek EH, MacDonald MJ, Fibich B, Mandic M (август 1988 г.). «Регулирование активности малатдегидрогеназы глутаматом, цитратом, альфа-кетоглутаратом и мультиферментным взаимодействием» (PDF) . Журнал биологической химии . 263 (22): 10687–97. doi : 10.1016/S0021-9258(18)38026-8 . PMID  2899080.

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки