Мечение MS2 — это метод, основанный на естественном взаимодействии белка оболочки бактериофага MS2 со структурой «стебель-петля» генома фага [1] , который используется для биохимической очистки комплексов РНК-белок и в сочетании с GFP для обнаружения РНК в живые клетки. [2] Совсем недавно этот метод стал использоваться для мониторинга появления РНК в живых клетках, в месте транскрипции или просто путем наблюдения за изменениями количества РНК в цитоплазме. [3] [4] Это показало, что транскрипция как прокариотических, так и эукариотических генов происходит прерывисто, со всплесками транскрипции , разделенными нерегулярными интервалами.
Начните с одноцепочечной РНК и создайте структуру структур «стебель-петля», добавляя копии РНК-связывающих последовательностей MS2 к некодирующей области. [5] Белок MS2 должен быть слит с GFP и связан с мРНК, комплексом, который содержит копии РНК-связывающей последовательности MS2. [5] Слитый белок MS2-GFP экспрессировали путем переноса его в клетку с помощью плазмиды [5] (лаборатория Роберта Сингера). Сигнал кодируется в РНК, и присутствие сигнала ядерной локализации (NLS) в GFP-MS2 представляет собой два сигнала, которые вводятся из комплексов EGFP-MS2-РНК. [6]
Аффинная очистка РНК, меченной биотином MS2 (MS2-BioTRAP), является одним из методов in vivo идентификации взаимодействий белок-РНК. [7] Экспрессировались как РНК, помеченная MS2, так и метка белка MS2, а затем аффинное взаимодействие использовалось для облегчения процесса идентификации взаимодействий белок-РНК. [7]
Преимущества:
Метод MS2-BioTRAP является быстрым, гибким и простым в настройке; он хорошо масштабируется и позволяет изучать физиологические условия взаимодействий белок-РНК. [7] Метка MS2 также эффективна для небольших молекул, когда белок оболочки MS2 используется для выделения различных рибонуклеопротеиновых частиц (РНП) . [8]
Недостатки:
Одним из недостатков мечения MS2 является то, что необходимо добавить множество копий стволовой петли MS2 внутри РНК, чтобы произвести достаточный сигнал для просмотра и отслеживания одной молекулы РНК в ядре. [5] При отслеживании более чем одной последовательности РНК в ядре культивируемых клеток необходимо более одной целевой последовательности. [5] На это может влиять белок MS2, который имеет классический базовый сигнал ядерной локализации (NLS), поэтому он может влиять на расположение комплекса РНК, и ядро будет иметь большую часть GFP-MS2 [5] ( лаборатория Роберта Сингера). [6] Накопление GFP-MS2 в ядре приведет к сильным сигналам ядерной флуоресценции, что задержит или предотвратит анализ ядерной локализации РНК, поскольку это будет препятствовать анализу сплайсинга, редактирования РНК, ядерного экспорта РНК и трансляция РНК. [6] Более того, из-за добавления метки во вторичную структуру РНК может вноситься артефакт. [5]
Кроме того, метка MS2 будет влиять на уровни экспрессии и регуляторные свойства малых некодирующих РНК (мРНК). [8] Кроме того, используя MS2 в качестве аффинной метки для очистки белка в бактериях E. coli , ученые экспрессировали MS2-MBP, который представляет собой белок оболочки MS2, несущий мутации, слитые с белками, связывающими мальтозу . Мутации предотвратили олигомеризацию . [8]