stringtranslate.com

Тегирование MS2

Мечение MS2 — это метод, основанный на естественном взаимодействии белка оболочки бактериофага MS2 со структурой «стебель-петля» генома фага [1] , который используется для биохимической очистки комплексов РНК-белок и в сочетании с GFP для обнаружения РНК в живые клетки. [2] Совсем недавно этот метод стал использоваться для мониторинга появления РНК в живых клетках, в месте транскрипции или просто путем наблюдения за изменениями количества РНК в цитоплазме. [3] [4] Это показало, что транскрипция как прокариотических, так и эукариотических генов происходит прерывисто, со всплесками транскрипции , разделенными нерегулярными интервалами.

Процедура

Начните с одноцепочечной РНК и создайте структуру структур «стебель-петля», добавляя копии РНК-связывающих последовательностей MS2 к некодирующей области. [5] Белок MS2 должен быть слит с GFP и связан с мРНК, комплексом, который содержит копии РНК-связывающей последовательности MS2. [5] Слитый белок MS2-GFP экспрессировали путем переноса его в клетку с помощью плазмиды [5] (лаборатория Роберта Сингера). Сигнал кодируется в РНК, и присутствие сигнала ядерной локализации (NLS) в GFP-MS2 представляет собой два сигнала, которые вводятся из комплексов EGFP-MS2-РНК. [6]

Аффинная очистка РНК, меченной биотином MS2 (MS2-BioTRAP), является одним из методов in vivo идентификации взаимодействий белок-РНК. [7] Экспрессировались как РНК, помеченная MS2, так и метка белка MS2, а затем аффинное взаимодействие использовалось для облегчения процесса идентификации взаимодействий белок-РНК. [7]

Преимущества и недостатки

Преимущества:

Метод MS2-BioTRAP является быстрым, гибким и простым в настройке; он хорошо масштабируется и позволяет изучать физиологические условия взаимодействий белок-РНК. [7] Метка MS2 также эффективна для небольших молекул, когда белок оболочки MS2 используется для выделения различных рибонуклеопротеиновых частиц (РНП) . [8]

Недостатки:

Одним из недостатков мечения MS2 является то, что необходимо добавить множество копий стволовой петли MS2 внутри РНК, чтобы произвести достаточный сигнал для просмотра и отслеживания одной молекулы РНК в ядре. [5] При отслеживании более чем одной последовательности РНК в ядре культивируемых клеток необходимо более одной целевой последовательности. [5] На это может влиять белок MS2, который имеет классический базовый сигнал ядерной локализации (NLS), поэтому он может влиять на расположение комплекса РНК, и ядро ​​будет иметь большую часть GFP-MS2 [5] ( лаборатория Роберта Сингера). [6] Накопление GFP-MS2 в ядре приведет к сильным сигналам ядерной флуоресценции, что задержит или предотвратит анализ ядерной локализации РНК, поскольку это будет препятствовать анализу сплайсинга, редактирования РНК, ядерного экспорта РНК и трансляция РНК. [6] Более того, из-за добавления метки во вторичную структуру РНК может вноситься артефакт. [5]

Кроме того, метка MS2 будет влиять на уровни экспрессии и регуляторные свойства малых некодирующих РНК (мРНК). [8] Кроме того, используя MS2 в качестве аффинной метки для очистки белка в бактериях E. coli , ученые экспрессировали MS2-MBP, который представляет собой белок оболочки MS2, несущий мутации, слитые с белками, связывающими мальтозу . Мутации предотвратили олигомеризацию . [8]

Рекомендации

  1. ^ Йоханссон Х.Э., Лильяс Л., Уленбек О.К. (1997). «Распознавание РНК белком оболочки фага MS2». Семинары по вирусологии . 8 (3): 176–185. дои : 10.1006/smvy.1997.0120.
  2. ^ Бертран Э., Чартран П., Шефер М., Шеной С.М., Сингер Р.Х., Лонг РМ (октябрь 1998 г.). «Локализация частиц мРНК ASH1 в живых дрожжах». Молекулярная клетка . 2 (4): 437–45. дои : 10.1016/s1097-2765(00)80143-4 . ПМИД  9809065.
  3. ^ Голдинг И., Паулссон Дж., Завильски С.М., Кокс EC (декабрь 2005 г.). «Кинетика генной активности отдельных бактерий в реальном времени». Клетка . 123 (6): 1025–36. дои : 10.1016/j.cell.2005.09.031 . PMID  16360033. S2CID  10319035.
  4. ^ Чабб-младший, Трчек Т, Шеной С.М., Сингер Р.Х. (май 2006 г.). «Транскрипционная пульсация гена развития». Современная биология . 16 (10): 1018–25. дои : 10.1016/j.cub.2006.03.092. ПМЦ 4764056 . ПМИД  16713960. 
  5. ^ abcdefg «Живой и в цвете | Журнал Scientist Magazine®». Ученый . Проверено 12 марта 2017 г.
  6. ^ азбука «Технологии». Люцерна, Инк . Проверено 12 марта 2017 г.
  7. ^ abc Marchese D, де Гроот Н.С., Лоренцо Готор Н., Ливи CM, Тарталья Г.Г. (ноябрь 2016 г.). «Достижения в характеристике РНК-связывающих белков». Междисциплинарные обзоры Wiley: РНК . 7 (6): 793–810. дои : 10.1002/wrna.1378. ПМК 5113702 . ПМИД  27503141. 
  8. ^ abc Саид Н., Ридер Р., Гурвиц Р., Декерт Дж., Урлауб Х., Фогель Дж. (ноябрь 2009 г.). «Экспрессия in vivo и очистка малых регуляторов РНК, меченных аптамерами». Исследования нуклеиновых кислот . 37 (20): е133. дои : 10.1093/nar/gkp719. ПМЦ 2777422 . ПМИД  19726584.