FAST ( Fluorescence-Activating and absorb-Shifting Tag ) — это генетически кодируемая белковая метка , которая при обратимом сочетании с флуорогенным хромофором позволяет сообщать об интересующих белках. FAST, небольшой белок 14 кДа, был разработан из фотоактивного желтого белка (PYP) путем направленной эволюции. Впервые он был раскрыт в 2016 году исследователями из Ecole normale supérieure de Paris . [1] FAST был далее преобразован в splitFAST (2019), систему комплементации для мониторинга взаимодействия белок-белок, и CATCHFIRE (2023), систему самоотчетной димеризации белков.
Флуоресцентная визуализация стала повсеместной в клеточной и молекулярной биологии. Флуоресцентные белки, подобные GFP, произвели революцию в флуоресцентной микроскопии, предоставив исследователям полный контроль над локализацией, функцией и судьбой маркированных конструкций. В последнее время были разработаны альтернативные системы, основанные на флуорогенном взаимодействии между белковой меткой, которая обеспечивает классические преимущества белковой маркировки, т. е . абсолютную специфичность маркировки и локализацию, и внешним хромофором, темным до сочетания с его родственной белковой меткой. Хромофоры охватывают как встречающиеся в природе хромофоры, например , флавинмононуклеотид (FMN) с доменами LOV-sensing , биливердин с фитохромами, билирубин с UnaG, так и синтетические флуорофоры с SNAP-tag , CLIP-tag , HaloTag . Хотя изначально эти системы были разработаны как флуоресцентные метки, они также предоставляют возможности для обнаружения и приведения в действие. [2]
FAST и его производные, splitFAST и CATCHFIRE, относятся к этим новым химико-генетическим стратегиям.
FAST — это белок из 125 аминокислот, созданный из светочувствительного PYP. Сам по себе он не флуоресцентный, но может селективно связывать флуорогенный хромофор, полученный из 4-гидроксибензилиден роданина, который сам по себе не флуоресцентен, если не связан. После связывания пара молекул проходит через уникальный механизм активации флуорогена, основанный на двух спектроскопических изменениях: увеличении квантового выхода флуоресценции и красном смещении поглощения, что обеспечивает высокую селективность маркировки. Было описано несколько версий FAST, отличающихся небольшим количеством мутаций, например , Y-FAST, iFAST, pFAST, greenFAST, redFAST, frFAST, nirFAST, nanoFAST или их димеры. Также было разработано несколько флуорогенных хромофоров, различающихся длиной волны испускания, яркостью и сродством к метке. Некоторые из них являются непроницаемыми, т. е . они не могут проходить через клеточные мембраны, поэтому они маркируют специфически мембранные белки или внеклеточные белки, что позволяет, например , отслеживать транспорт от синтеза до выведения. [3]
FAST участвует в гонке за получение изображений в ближнем инфракрасном диапазоне, столь необходимом для получения изображений всего организма, обеспечивая при этом глубокое проникновение в ткани, снижение фотоповреждения живых организмов и высокое отношение сигнал/шум. [4]
splitFAST — это система флуоресцентной комплементации для визуализации временных белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Разработанная на основе флуорогенного репортера FAST, splitFAST состоит из двух белковых фрагментов, NFAST (114 аминокислот) и CFAST (10 или 11 аминокислот). Каждый из них генетически слит с одним интересующим белком, они, при взаимодействии с соответствующими им белками, восстанавливают полный FAST, который затем способен объединяться с любым флуорогеном FAST и освещать взаимодействие. splitFAST предлагает мощную альтернативу традиционным методам визуализации белок-белковых взаимодействий, т. е . резонансному переносу энергии Фостера (FRET) и бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC). Действительно, простая в реализации, комплементация splitFAST была показана полностью обратимой и быстрой разборкой, что позволяет не только контролировать сборку белкового комплекса в реальном времени, но и контролировать разборку белкового комплекса в реальном времени. [5]
Трехкомпонентный splitFAST получил дальнейшее развитие. [6]
Эволюция FAST и splitFAST, CATCHFIRE реализует генетическое слияние пары интересующих белков с небольшими димеризующимися доменами на основе FAST, FIRE tag и FIRE mate. Добавление флуорогенных индукторов, малых молекул серии «match», например , match 540, match 550, match Dark, управляет взаимодействием между FIRE tag и FIRE mate, тем самым вызывая близость интересующих белков. Когда оба домена взаимодействуют, молекула match увеличивает свою флуоресценцию в 100 раз. Затем можно наблюдать вновь индуцированное взаимодействие с помощью флуоресцентной микроскопии. Еще одной ключевой особенностью CATCHFIRE является ее обратимость, следовательно, это первая в истории обратимая димеризующая система с самоотчетом. CATCHFIRE позволяет контролировать и отслеживать локализацию белка, транспортировку белка, транспорт органелл и клеточные процессы, открывая возможности для изучения или контроля биологических процессов с высоким пространственно-временным разрешением. Его флуорогенная природа позволяет разработать новый класс биосенсоров для изучения таких процессов, как передача сигнала и апоптоз. [7]
Система отчетности FAST-fluorogen используется для исследования живого мира, от отчетности по белкам ( например , для транспортировки белков ), мониторинга взаимодействия белок-белок (и ряда биосенсоров ) до химически индуцированной димеризации . Она реализована в флуоресцентной микроскопии , проточной цитометрии и любых других флуорометрических методах. FAST также был описан для микроскопии сверхвысокого разрешения живых клеток. [8]
Благодаря своей уникальной способности флуоресценции в условиях отсутствия кислорода, FAST широко использовался в анаэробах, например, для обеспечения метаболической инженерии Clostridium или родственных бактерий, давно известных в ферментации биомассы. [9] С той же целью он использовался в метаногенных археях , а именно Methanococcus maripaludis и Methanosarcina acetivorans. [10] Он также был реализован для исследований патогенов, т. е . бактерии Clostridioides difficile [11] и простейших Giardia intestinalis . [12]
Кроме того, FAST позволяет контролировать микробную активность в условиях низкого содержания кислорода, например, в созревающих биопленках [13] или в опухолях или микробиоте кишечника. [14]
Благодаря своему небольшому размеру и обратимости, а следовательно, ограниченному влиянию на функцию и взаимодействие белков, FAST и splitFAST использовались в грибах, а именно Saccharomyces cerevisiae , для мониторинга метаболической инженерии [15] и в патологических бактериях, а именно Listeria monocytogenes , для изучения факторов их бактериальной вирулентности [16] .
Помимо микроорганизмов, FAST и splitFAST начали широко распространяться в исследованиях механизмов в клетках млекопитающих. Они помогли выяснить роль специального GPCR в созревании дендритных шипиков [17] , а также механизм действия интерферон-индуцируемого белка MX1 против гриппа A. [18] splitFAST использовался в исследованиях участков мембранного контакта (MCS) между мембранными органеллами, растущей области в медицинских исследованиях, например , для соединения эндоплазматического ретикулума и митохондрий. [19] Кроме того, липидные капли, оснащенные splitFAST, были разработаны для проведения исследований взаимодействия липидных капель. [20]