МикроДНК является наиболее распространенным подтипом внехромосомной кольцевой ДНК (eccDNA) у людей, обычно длиной от 200 до 400 пар оснований и обогащена неповторяющимися геномными последовательностями с высокой плотностью экзонов. [2] [3] [4] Кроме того, было обнаружено, что микроДНК происходит из регионов с CpG-островками , которые обычно находятся в пределах 5' и 3' НТО. [3] [4] [5] Предполагается, что микроДНК, производимая из регионов активной транскрипции, может образовываться как побочный продукт транскрипционного восстановления повреждений ДНК. [5] Также считается, что микроДНК возникает из других путей восстановления ДНК, в основном из-за того, что родительские последовательности микроДНК имеют от 2 до 15 п.н. прямых повторов на концах, что приводит к восстановлению проскальзывания репликации. [3] Хотя это было обнаружено совсем недавно, роль, которую микроДНК играет внутри и вне клетки, до сих пор полностью не изучена. [5] Однако в настоящее время считается, что микроДНК влияет на клеточный гомеостаз посредством связывания факторов транскрипции и используется в качестве биомаркера рака. [5] [6] [7]
МикроДНК была обнаружена с помощью протоколов, аналогичных протоколам экстракции eccDNA. [5] В частности, клоны eccDNA были получены с помощью многократной амплификации смещения и секвенированы с помощью секвенирования по Сэнгеру , что привело к открытию микроДНК. [5] Теперь, когда высокопроизводительное секвенирование стало более распространенной практикой, полная геномная последовательность eccDNA млекопитающих была получена с помощью секвенирования продуктов прокатки амплификации eccDNA. [5] Затем вычислительные методы были использованы для идентификации соединительных последовательностей в ДНК. [4] Пики, обнаруженные на длинах 180 и 380 п.н., были обнаружены как микроДНК и охарактеризованы их CpG-островками и фланкирующими 2-15 п.н. прямыми повторами. [4]
С момента своего открытия микроДНК была идентифицирована во всех типах тканей и различных образцах, включая мышиные ткани и линии раковых клеток человека. [5] [6] Однако разные виды имеют уникальные геномные участки, которые специфически продуцируют микроДНК. [5] Поскольку существуют общие геномные пятна, которые продуцируют микроДНК в нескольких типах клеток и тканей в пределах данного вида, есть доказательства того, что они не могут продуцироваться исключительно как побочный продукт синтеза ДНК. [5] Однако исследования выявили отдельную кластеризацию микроДНК, извлеченной из клеточных линий разных тканей, что позволяет предположить, что формирование может быть связано с клеточной линией и уникальными транскрипционными средами, обнаруженными в разных типах клеток. [4] [5]
Хотя формирование микроДНК все еще не определено, его связывают с транскрипционной активностью и множественными путями репарации ДНК. [3] [5] Поскольку микроДНК образуется в областях с высокой транскрипционной активностью/плотностью экзонов, она может образовываться в результате репарации ДНК во время транскрипции. [5] Интересно, что трехцепочечные гибриды ДНК:РНК, образующиеся во время транскрипции, называемые R-петлями , имеют тенденцию образовываться на CpG-островках в пределах 5' и 3' НТО, подобно микроДНК. [3] [5] R-петли коррелируют с повреждением ДНК и генетической нестабильностью, что позволяет предположить, что микроДНК может образовываться из петли одноцепочечной ДНК (ssDNA) во время ответа на повреждение ДНК для R-петель. [3] [5] [6]
При репликации ДНК коротких прямых повторов (которые обнаруживаются во фланкирующих областях источников генов микроДНК) возможно образование петель ДНК на родительской или продуктовой цепи посредством проскальзывания репликации. [3] [5] Чтобы исправить это, путь репарации несоответствий (MMR) может удалить петлю, и при лигировании повторяющихся концов может быть получена одноцепочечная микроДНК. [3] Затем одноцепочечная микроДНК преобразуется в двухцепочечную ДНК; этот процесс до сих пор неизвестен. [5] Важно отметить, что если петля образуется на вновь реплицированной цепи, в геноме не происходит последующей делеции, в то время как микроделеции могут образовываться в результате вырезания в матричной цепи. [3] [5] Чтобы понять роль MMR в биогенезе микроДНК, был проведен анализ распространенности микроДНК в клетках DT40 после удаления MSH3 , необходимого белка в MMR. [3] [5] Полученная микроДНК из клеточной линии DT40 MSH3-/- имела более высокое обогащение CpG-островков по сравнению с диким типом, а также более чем 80% снижение двухцепочечной микроДНК. [3] [5] Таким образом, предполагается, что путь MMR необходим для продукции микроДНК из не-CpG-островков в геноме, в то время как CpG-обогащенные микроДНК образуются другим путем репарации. [3]
Опять же, из-за микрогомологии в шаблонном геноме, если происходит разрыв ДНК или пауза в репликации (остановка репликативной вилки), вновь синтезированная ДНК может закольцеваться в одноцепочечную микроДНК. [3] [5] Это означает, что когда шаблонная ДНК восстанавливается после создания микроДНК, делеции не происходит. [3]
МикроДНК, созданная посредством пути MMR и остановки репликационной вилки, является результатом ошибок в репликации ДНК, однако есть доказательства того, что микроДНК присутствует и в неделящихся клетках. [5] Это означает, что часть микроДНК производится посредством путей репарации, которые также встречаются в покоящихся клетках, например, с 5'-концов элементов LINE1 , которые, как известно, транспонируют. [3] [5] Для перемещения по геному ДНК-транспозонам требуется транспозаза для удаления транспозона из его исходного сайта и катализирования его вставки в другом месте генома. [3] Таким образом, транспозон создается двумя двухцепочечными разрывами ДНК, также создавая микроделецию в ДНК. [3] Этот фрагмент дцДНК может быть кольцевым посредством микрогомологически опосредованной кольцевой формы, создавая дц-микроДНК. [3]
Имея длину 200-400 п.н., микроДНК слишком малы для кодирования белков, однако они могут быть важны для молекулярного губчатого расщепления. [4] [5] Факторы транскрипции часто связываются с промоторными или регуляторными последовательностями на 5'-конце ДНК для инициирования транскрипции. [5] Эти факторы транскрипции также могут связываться с соответствующими им сайтами распознавания на микроДНК, поскольку микроДНК часто происходит из 5'-нетранслируемых областей родительского гена, поэтому действует как губка для факторов транскрипции. [4] [5] Это означает, что микроДНК может косвенно контролировать экспрессию генов и гомеостаз транскрипции. [4] [5]
В целом, молекулы нуклеиновых кислот, которые находятся в кровотоке, называемые циркулирующими или бесклеточными, являются относительно новым биомаркером заболеваний, который изучается, в том числе для диагностики и прогрессирования рака. [7] Эти молекулы, такие как бесклеточная ДНК (cfDNA), высвобождаются в кровь после гибели клеток и в случаях рака могут быть идентифицированы на основе известных мутаций в онкогенах. [7]
Недавние исследования расширили использование бесклеточных нуклеиновых кислот в качестве биомаркеров рака до микроДНК. [7] cfmicroDNA была получена из сыворотки человека и мыши, и из-за их сходства с клеточной микроДНК, как описано выше, был сделан вывод, что cfmicroDNA вырабатывается в клетке. [7] Аналогичным образом, при сравнении легочной ткани до и после удаления опухоли не было обнаружено никакой разницы в ключевых характеристиках циркулирующей микроДНК, за исключением неожиданной тенденции более длинных циркулирующих последовательностей микроДНК у онкологических пациентов до удаления опухоли. [7] Было обнаружено, что длина cfmicroDNA короче после операции. [7]
Бесклеточная ДНК быстро выводится из крови, что делает ее сложным биомаркером рака. [7] Однако, поскольку кольцевая ДНК не подвержена разрыву ДНК РНКазой и экзонуклеазой , она более стабильна, чем линейная ДНК. [5] [7] В сочетании с наблюдаемым удлинением cfmicroDNA в сыворотке больных раком, это делает циркулирующую микроДНК хорошим биомаркером рака как для диагностики, так и для прогрессирования после лечения. [7]