Микрокристаллизация (или микрокристаллический тест ) — это метод идентификации метаболитов лишайников , который преимущественно использовался до появления более продвинутых методов, таких как тонкослойная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография . Разработанный в первую очередь Ясухико Асахиной , этот подход основан на образовании характерных кристаллов из экстрактов лишайников . Хотя в настоящее время он вытеснен современными аналитическими методами , микрокристаллизация по-прежнему сохраняет важное значение для очистки и анализа соединений с использованием рентгеновской кристаллографии .
В период с 1936 по 1940 год [1] [2] японский химик и лихенолог Ясухико Асахина опубликовал серию статей в журнале «Journal of Japanese Botany», в которых подробно описывалась методика микрокристаллизации. [3] [4] Этот простой и быстрый метод позволил идентифицировать основные метаболиты в сотнях видов лишайников, внеся значительный вклад в таксономические исследования. [4] Метод был представлен западным лихенологам в публикации 1943 года Александра Эванса [ 5] и использовался регулярно до тех пор, пока не были внедрены и интегрированы в лаборатории более продвинутые методы, такие как тонкослойная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография . Десятилетия исследований вторичных метаболитов лишайников достигли кульминации в публикации « Идентификация лишайниковых веществ » — работы 1996 года Зигфрида Хунека и Исао Йошимуры, в которой были обобщены аналитические данные для сотен молекул лишайников, включая изображения микрокристаллов. [6] В конечном итоге, метод микрокристаллизации имел ограничения, поскольку он не позволял обнаруживать второстепенные компоненты или анализировать сложные смеси лишайниковых веществ. [7] [8] Несмотря на эти недостатки, микрокристаллизация сыграла решающую роль в изучении корреляций между химией лишайников, морфологией и географическим распространением. [8]
Для проведения микрокристаллизации небольшой кусочек лишайника извлекается с помощью ацетона или других растворителей , фильтруется и выпаривается для получения остатка . [7] [3] [9] Остаток переносится на предметное стекло микроскопа , и капля реагента для микрокристаллизации добавляется перед тем, как закрыть покровным стеклом . [7] Обычно используемые реагенты включают GAW (H 2 O/ глицерин / этанол 1:1:1, об./об./об.) и GE ( уксусная кислота /глицерин 1:3). [7] Предметные стекла с использованием GE или GAW осторожно нагреваются, а затем им дают остыть, что способствует процессу кристаллизации. [7] [3] После образования кристаллы лучше всего наблюдать в поляризованном свете с 200–1000-кратным увеличением. [7]
Для этого метода требуется базовое лабораторное оборудование, включая микроскоп, оборудованный для поляризованного света, пробирки , пипетки , микроспиртовку или микрогорелку Бунзена , шпатель или скальпель , а также предметные стекла и покровные стекла. [3] Лишайниковые вещества можно идентифицировать на основе отличительной формы и цвета их кристаллов. [7] [3]
Процесс идентификации кристаллов включает их сравнение с изображениями кристаллов в различных растворителях, найденными в опубликованных источниках. Хотя форма кристаллов зависит от растворителя и, в определенной степени, от концентрации вещества, обычно можно распознать основные кристаллические формы. Следует проявлять осторожность, чтобы различать нерастворенные вещества, которые могут быть кристаллическими, но не иметь характерной формы, и перекристаллизованные вещества. Образцы микрокристаллов не могут храниться долго, так как они начинают разрушаться в течение нескольких часов или дней. [10]
Различение гирофоровой кислоты и леканоровой кислоты с помощью тонкослойной хроматографии может быть сложной задачей. Однако, если известно, что одно из этих веществ присутствует, микрокристаллический тест может помочь дифференцировать их. В системе растворителей GAW леканоровая кислота образует длинные, изогнутые кристаллические кластеры, хотя результаты могут быть непоследовательными, особенно в присутствии других веществ. Гирофоровая кислота, когда присутствует в системе растворителей GE, может проявляться в виде небольших, тонких кристаллических кластеров или округлых скоплений мелких кристаллов. Леканоровая кислота в системе растворителей GE образует игольчатые кристаллические кластеры, но они не так хорошо сформированы, как в GAW. Эти тесты могут помочь отличить Punctelia borreri (которая содержит гирофоровую кислоту) от Punctelia subrudecta (которая содержит леканоровую кислоту). [10]
Когда два вещества генерируют похожие на вид кристаллы, их оптические свойства могут быть использованы для их различения. Некоторые кристаллы изменяют плоскость поляризации проходящего света, и при вращении между скрещенными поляризаторами они чередуются между ярким и темным каждые 90°. Угол экстинкции - это угол между определенной осью кристалла и плоскостью поляризации фильтра, когда кристалл кажется темным (при экстинкции). Например, этот метод можно использовать для различения перлатолевой кислоты и имбрикаровой кислоты, которые обе образуют длинные прямые кристаллы в системе растворителя GE, но демонстрируют углы экстинкции 0° и 45° соответственно по отношению к их длинной оси. [10]