Начальная точка — это основная контрольная точка клеточного цикла у дрожжей , известная как точка ограничения у многоклеточных организмов. [1] Контрольная точка «Начало» обеспечивает вход в клеточный цикл, даже если условия позже станут неблагоприятными. Физиологические факторы, которые контролируют прохождение через контрольную точку «Старт», включают внешние концентрации питательных веществ, наличие фактора спаривания/феромона, формы стресса и контроль размера. [2]
Стремясь изучить упорядоченные события клеточного цикла, Леланд Хартвелл и др. скринировали и охарактеризовали чувствительные к температуре мутанты, также известные как мутанты цикла клеточного деления (мутанты cdc), которые демонстрируют остановку клеточного развития на различных стадиях цикла. [3] Хартвелл не только идентифицировал мутант, cdc28, который останавливается на очень ранних стадиях клеточного цикла, но он также признал, что присутствие факторов спаривания может привести к сходным фенотипам ингибированного образования почек и отсутствию синтеза ДНК. Примечательно, что клетки, подвергшиеся воздействию факторов спаривания на более поздних стадиях цикла, продолжали деление и останавливались только тогда, когда образовавшиеся дочерние клетки достигли «ранних стадий» (или, более технически, фазы G1) клеточного цикла. Эти результаты позволяют предположить, что и cdc28, и феромоны спаривания опосредуют такие ранние события, а также позволяют предположить, что существует точка в клеточном цикле, когда клетка переходит к делению, а не к спариванию. Хартвелл назвал эту точку «Начало», когда клетки чувствительны к феромонам спаривания до достижения этой стадии, но нечувствительны к факторам спаривания после этого.
За годы, прошедшие после трудоемких экспериментов Хартвелла, было показано, что другие факторы окружающей среды способствуют клеточной судьбе у дрожжей и, аналогично, у других организмов. Критическое исследование, проведенное Зеттербергом и др. , хотя и не специфично для дрожжей . в 1985 году представили доказательства существования точки коммитирования в клетках Swiss 3T3 или фибробластах эмбрионов мыши при выращивании в условиях сыворотки или сыворотки. [4] Как и реакция на спаривающиеся феромоны в экспериментах Хартвелла, реакция на сывороточное голодание не была одинаковой среди всех клеток. В этих условиях только постмитотические клетки моложе трех часов задерживали клеточное деление, тогда как клетки старше четырех часов были нечувствительны к отсутствию факторов роста. Эти экспериментальные результаты демонстрируют убедительные доказательства наличия точки фиксации для вступления в митоз и, следовательно, предполагают, что клетка способна воспринимать окружающую среду на предмет таких сигналов, как факторы роста, прежде чем совершить митоз.
Транскрипция нескольких генов G1/S необходима для прохождения клетками клеточного цикла. У почкующихся дрожжей транскрипция более 200 генов активируется при переходе G1/S. [5] Транскрипция этих генов G1/S в первую очередь регулируется двумя регуляторными белками генов, SBF и MBF. Эти регуляторные белки образуют комплексы с SCB и MCB соответственно, которые расположены на промоторах генов G1/S. [2]
Комплексы SBF и MBF способны активировать транскрипцию G1/S только в том случае, если диссоциирует белок-ингибитор, известный как Whi5 . Диссоциация Whi5 требует фосфорилирования комплексом Cln3- Cdk1 . [2] Это указывает на то, что активность Cln3-Cdk1 играет важную роль в контрольной точке Start из-за ее необходимости одновременно активировать белки SBF и MBF. Активность Cln3 коррелирует со скоростью роста клеток. [2]
Гены G1/S включают циклины Cln1 и Cln2, которые могут образовывать активные комплексы с Cdk1. Эти активированные комплексы Cln-Cdk помогают активировать комплексы S-Cdk, которые обычно ингибируются Sic1. [2] Sic1 не оказывает влияния на комплексы Cln-Cdk. Комплексы Cln-Cdk активируют комплексы S-Cdk посредством разрушения Sic1 путем фосфорилирования и последующего убиквитинирования SCF .
Реакция на феромоны спаривания, описанная в экспериментах Хартвелла [3], неудивительна, учитывая антагонистические биохимические взаимодействия между путем спаривания и циклинами G1, которые способствуют прогрессированию клеточного цикла.
Как показано на сопроводительном рисунке, [6] путь спаривания состоит из каскада MAPK (митоген-активируемой протеинкиназы), где Ste5 промежуточно передает сигнал феромона и последующие киназные ответы с помощью Ste11, Ste7 и Fus3. Благодаря своим последующим и даже непосредственным эффектам Fus3 в конечном итоге активирует Far1, который напрямую ингибирует активность циклинов G1, Cln1/2.
В свою очередь, Cln1/2 напрямую ингибирует путь спаривания посредством ингибирования Far1 и Ste5. Активность Cln1/2 опосредована активацией циклина G1, расположенного выше, Cln3. Cln3 вместе с циклин-зависимой киназой Cdc28 инактивирует и способствует экспорту ядерного Whi5. Экспорт Whi5 приводит к частичной активации факторов транскрипции SBF и MBF, которые в конечном итоге способствуют развитию клеточного цикла. Эти факторы транскрипции способствуют экспрессии Cln1/2 и усиливают реакцию клеточного цикла, образуя петлю положительной обратной связи, поскольку Cln1/2 способствует активации SBF и экспорту Whi5.
Современное исследование, описывающее взаимосвязь между остановкой спаривания и прогрессированием клеточного цикла, было проведено Doncic et al. в июне 2011 года. [6] Признавая, что количество ядерного Whi5 является индикатором активности циклина G1, авторы решили количественно понять момент, в котором клетки начинают делиться. С помощью микрофлюидной платформы асинхронная популяция клеток подвергалась воздействию феромона альфа-фактора. Используя слитый белок Whi5-GFP, они отслеживали количество ядерного Whi5 после добавления альфа-фактора и отмечали, останавливалась ли клетка или продолжала деление. Как и ожидалось, клетки pre-Start прекращали клеточное деление при добавлении феромона, на что указывает небольшая доля экспорта Whi5. И наоборот, клетки post-Start были нечувствительны к альфа-фактору и продолжали делиться, о чем свидетельствует большая доля экспорта Whi5. Таким образом, дифференциальный ответ на присутствие феромонов отражается в том, находится ли клетка в состоянии до или после старта, которое можно охарактеризовать тем, сколько Whi5 присутствует в ядре. Затем логистическая регрессия была использована для расчета вероятности остановки по отношению к доле экспортированного Whi5 и показала резкий переход между остановкой и прогрессированием, когда примерно 50% Whi5 было экспортировано из ядра. Было также показано, что эта доля экспортируемого Whi5 соответствует активации петли положительной обратной связи Cln1/2 (см. ниже). В заключение это означает, что этот старт определяется активацией контура обратной связи Cln1/2.
Как упоминалось выше, циклины G1, Cln1/2, являются частью петли положительной обратной связи, которая способствует их собственной транскрипции и активации транскрипционных факторов SBF и MBF. В 2008 году Скотхайм и др. предположили, что эта петля обратной связи обеспечивает сильный сигнал, способствующий клеточному делению, с помощью генов, регулируемых SBF и MBF. [5] Они выдвинули гипотезу, что без согласованной экспрессии генов, необходимых для ранних событий, таких как репликация ДНК и образование зачатков, случайные отдельные клеточные сигналы создают шум, который ослабляет реакцию обязательства. Отмечая длительное и асинхронное время индукции CLN2 и RAD27 (гена в регулоне SBF/MBF) в клетках cln1∆cln2∆ по сравнению с клетками дикого типа, Skotheim et al. Таким образом, пришли к выводу, что механизм положительной обратной связи Cln1/2 обеспечивает синхронную и более эффективную экспрессию регулона SBF/MBF.
Авт. далее заметили, что фосфорилирование Whi5 и последующая инактивация играют роль в этой реакции положительной обратной связи. Аллель Whi5, лишенная шести из двенадцати сайтов фосфорилирования, приводит к медленному выходу из ядра и, следовательно, к менее последовательной индукции экспрессии CLN2 и RAD27. Таким образом, неспособность фосфорилировать Whi5 нарушает петлю положительной обратной связи Cln1/2 и, в свою очередь, снижает когерентную экспрессию регулона.
Чтобы дополнительно прояснить биохимическое объяснение между остановкой спаривания и обязательством клеточного цикла, Doncic et al. провели тот же анализ фиксации, описанный выше, на различных мутантных штаммах. [6] У мутанта FAR1-S87A отсутствуют сайты фосфорилирования CDK, и, таким образом, ингибирование Cln1/2 Far1 нарушено. Результатом является увеличение количества экспорта Whi5, необходимого для участия в клеточном делении, что позволяет предположить, что фосфорилирование Far 1 является ключом к клеточному участию. И наоборот, мутант STE5-8A, у которого также отсутствуют сайты фосфорилирования CDK (и, таким образом, ингибирование Ste5 Cln1/2 нарушено), не смещает точку коммитирования, указывая тем самым, что такое ингибирование пути спаривания не является критическим для Start. Дальнейший временной анализ клеток STE5-8A показывает, что эти мутантные клетки не могут полностью перейти к клеточному делению, поскольку клетки, подвергшиеся воздействию альфа-фактора, отпочковываются, а затем возвращаются к спариванию, не завершая клеточный цикл. Дончич и др. предположили, что неполное деление происходит из-за экспрессии генов как на пути спаривания, так и в клеточной прогрессии, управляемой циклином G1. Действительно, отслеживание экспрессии FUS1pr-GFP, гена пути спаривания, и CLN2pr-mCherry, гена клеточного цикла, показало большую коэкспрессию в клетках STE5-8A по сравнению с клетками дикого типа.
Таким образом, ингибирование Cln1/2 Far1 позволяет войти в клеточный цикл (Start), тогда как ингибирование Ste5 гарантирует четкую экспрессию генов либо для пути спаривания, либо для прогрессирования клеточного цикла.
Внешние концентрации питательных веществ чрезвычайно важны для прохождения контрольной точки «Старт». Доступность питательных веществ сильно коррелирует с размером роста клеток. Клетки не будут развиваться, если они не достигнут определенного размера из-за недостатка питательных веществ, обычно азота. Таким образом, более крупные ячейки проводят меньше времени в контрольной точке «Начало» по сравнению с меньшими ячейками. [2]