Осаждение сульфатом аммония является одним из наиболее часто используемых методов очистки и фракционирования белков в крупных и лабораторных масштабах, который можно использовать для разделения белков путем изменения их растворимости в присутствии высокой концентрации соли.
Сульфат аммония — неорганическая соль с высокой растворимостью, которая распадается на аммоний ( NH+
4) и сульфат ( SO2−
4) в водных растворах. [1] Сульфат аммония особенно полезен в качестве осадителя, поскольку он хорошо растворяется, стабилизирует структуру белка, имеет относительно низкую плотность, легко доступен и относительно недорог.
Сульфат аммония, а также другие нейтральные соли, стабилизируют белки путем преимущественной сольватации . Белки обычно хранятся в сульфате аммония, поскольку он подавляет рост бактерий. При добавлении сульфата аммония белки, развернутые денатурантами, могут быть переведены в их нативные конформации. Это можно увидеть при сворачивании рекомбинантных белков. [2]
Растворимость белков варьируется в зависимости от ионной силы раствора, то есть в зависимости от концентрации соли. При низких концентрациях ионов (менее 0,5 моль/л) растворимость белков увеличивается с ростом концентрации соли, эффект называется « высаливанием ». По мере дальнейшего увеличения концентрации соли растворимость белка начинает уменьшаться. При достаточно высокой ионной силе белок будет выпадать в осадок из раствора, эффект называется « высаливанием ». [3] Когда аммоний ( NH+
4) и сульфат ( SO2−
4) ионы находятся в водном растворе, они притягиваются к противоположным зарядам, которые видны на очищаемом соединении. Это притяжение противоположных зарядов препятствует взаимодействию молекул воды с очищаемым соединением, что приводит к осаждению или «высаливанию». [2]
Белки заметно различаются по своей растворимости при высокой ионной силе, поэтому «высаливание» является очень полезной процедурой для содействия очистке желаемого белка. Сульфат аммония обычно используется для осаждения из-за его высокой растворимости, кроме того, он образует два иона высоко в ряду Гофмейстера . Поскольку эти два иона находятся в конце ряда Гофмейстера, сульфат аммония также может стабилизировать структуру белка. [3] Поведение растворимости сульфата аммония для белка обычно выражается как функция процента насыщения. Кривую растворимости можно определить, построив логарифм экспериментально определенной растворимости, выраженной в мг/мл, в зависимости от процента насыщения сульфата аммония. [4]
При механизме высаливания происходит исключение соли из слоя воды, который тесно связан с поверхностью белка, известной как слой гидратации. Слой гидратации играет жизненно важную роль в поддержании растворимости и подходящей естественной конформации. Существует три основных взаимодействия белок-вода: ионная гидратация между заряженными боковыми цепями, водородные связи между полярными группами и водой и гидрофобная гидратация. После добавления соли в смесь происходит увеличение поверхностного натяжения воды, тем самым увеличивая гидрофобные взаимодействия между водой и интересующим белком. Затем интересующий белок уменьшает свою площадь поверхности, что уменьшает его контакт с растворителем. Это показано сворачиванием и самоассоциацией, что в конечном итоге приводит к осаждению. Сворачивание и самоассоциация белка выталкивают свободную воду, что приводит к увеличению энтропии и делает этот процесс энергетически выгодным. [2]
Обычно концентрация сульфата аммония увеличивается ступенчато, и осажденный белок извлекается на каждой стадии. Обычно это делается путем добавления твердого сульфата аммония; однако расчет количества сульфата аммония, которое следует добавить в раствор для достижения желаемой концентрации, может быть затруднен, поскольку добавление сульфата аммония значительно увеличивает объем раствора. Количество сульфата аммония, которое следует добавить в раствор, можно определить по опубликованным номограммам или с помощью онлайн-калькулятора. [5] Прямое добавление твердого сульфата аммония действительно изменяет pH раствора, что может привести к потере активности фермента. [6] В этих случаях добавление насыщенного сульфата аммония в подходящем буфере используется в качестве альтернативы добавлению твердого сульфата аммония. В любом подходе полученный осадок белка можно растворить индивидуально в стандартном буфере и проанализировать для определения общего содержания белка.
Концентрацию добавляемого сульфата аммония следует увеличить до значения, которое осаждает большую часть интересующего белка, оставляя при этом максимальное количество белковых примесей в растворе. Осажденный интересующий белок может быть впоследствии извлечен центрифугированием и растворен в стандартном буфере для подготовки образца к следующему этапу очистки.
На следующем этапе очистки всю эту добавленную соль необходимо удалить из белка. Один из способов сделать это — использовать диализ, но диализ еще больше разбавляет концентрированный белок. Лучший способ удаления сульфата аммония из белка — смешать осадочный белок в буфере, содержащем смесь SDS, Tris-HCl и фенола, и центрифугировать смесь. Осадок, который выходит из этого центрифугирования, будет содержать концентрированный белок без соли. [7]
Осаждение сульфатом аммония является полезным методом в качестве начального шага в очистке белка, поскольку оно обеспечивает быстрое, объемное осаждение клеточных белков. [4] Его также часто используют на более поздних стадиях очистки для концентрирования белка из разбавленного раствора после таких процедур, как гель-фильтрация . Недостатком этого метода является то, что часто вместе с белком могут осаждаться и другие вещества, и необходимо применять другие методы очистки, такие как ионная хроматография или гель-хроматография . [3]