ПЭГилирование лизоцима представляет собой ковалентное присоединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) к лизоциму, который является одним из наиболее широко исследованных ПЭГилированных белков.
ПЭГилирование белков стало обычной практикой современных терапевтических препаратов, поскольку этот процесс способен повышать растворимость, термическую стабильность, устойчивость к ферментативному расщеплению и период полураспада в сыворотке интересующих белков. [1] [2] Лизоцим , как природный бактерицидный фермент, лизирует клеточную стенку различных грамположительных бактерий и обеспечивает защиту от микробных инфекций. [2] Лизоцим имеет шесть остатков лизина, которые доступны для реакций ПЭГилирования. [3] Таким образом, ПЭГилирование лизоцима , или ПЭГилирование лизоцима, может быть хорошей модельной системой для ПЭГилирования других белков с ферментативной активностью, демонстрируя повышение его физической и термической стабильности при сохранении его активности. [2]
Предыдущие работы по ПЭГилированию лизоцима продемонстрировали различные хроматографические схемы для очистки ПЭГилированного лизоцима, которые включали ионообменную хроматографию , хроматографию гидрофобного взаимодействия и гель-хроматографию ( быструю жидкостную хроматографию белков ), и доказали его стабильную конформацию с помощью кругового дихроизма и улучшенную термическую стабильность с помощью анализов ферментативной активности, SDS-PAGE и гель-хроматографии ( высокоэффективной жидкостной хроматографии ). [1] [4] [5]
Химическая модификация лизоцима путем ПЭГилирования включает добавление метокси-ПЭГ-альдегида (мПЭГ-альдегида) с различными молекулярными размерами, в диапазоне от 2 кДа до 40 кДа, к белку. [6] [7] Белок и мПЭГ-альдегид растворяются с использованием натрий-фосфатного буфера с цианоборогидридом натрия , который действует как восстановитель и обуславливает сильное сродство альдегидной группы мПЭГ-альдегида к остатку лизина на N-конце лизоцима. [7] Обычно используемое молярное соотношение лизоцима и мПЭГ-альдегида составляет 1:6 или 1:6,67. [6] [5] Когда достигается достаточное ПЭГилирование , реакцию можно остановить добавлением лизина в раствор или кипячением раствора. [2] [8] Различные профили могут привести к ПЭГилированию белка, которое включает в себя интактное моно-ПЭГилирование, ди-ПЭГилирование, три-ПЭГилирование, а также, возможно, их изоформы . [5]
Ионообменная хроматография часто используется на первом этапе или этапе захвата для разделения ПЭГилированных белков, поскольку ПЭГилирование может влиять на заряды целевых белков путем нейтрализации электростатического взаимодействия , изменения изоэлектрической точки (pI) и увеличения значения pKa . [2] Из-за высокого pI лизоцима (pI = 10,7) используется катионообменная хроматография. [2] [9] Поскольку повышенная степень ПЭГилирования снижает ионную силу белка, поли-ПЭГилированные белки имеют тенденцию связываться с катионной смолой слабее, чем моно-ПЭГилированный белок или интактная форма. Таким образом, поли-ПЭГилированные белки элюируются быстрее, а интактный белок ускользает последним в катионообменной хроматографии. [10] Поскольку моно-ПЭГилирование широко исследовано и описано как защита целевых белков, целевым элюатом в катионообменной хроматографии обычно являются моно-ПЭГилированные белки. [7]
Несмотря на возможности катионообменной хроматографии в процессе очистки, гидрофобная хроматография также используется, обычно на втором этапе в качестве этапа полировки. Используя относительно небольшую катионообменную смолу, катионообменная хроматография может идентифицировать и разделять изоформы по кажущимся зарядам в состоянии, но гидрофобная хроматография способна идентифицировать и разделять изоформы по их гидрофобности. [11]
Из-за очевидных различий в размерах в зависимости от степени ПЭГилирования белка можно использовать гель-хроматографию ( быструю жидкостную хроматографию белков или FPLC). [4] [5] Существует отрицательная корреляция между молекулярной массой и временем удерживания ПЭГилированного белка на хроматограмме: более крупный белок или более ПЭГилированный белок элюируется первым, а меньший белок или интактный белок — последним. [2]
Наиболее распространенные анализы для идентификации интактного и ПЭГилированного лизоцима можно проводить с помощью гель-хроматографии ( высокоэффективной жидкостной хроматографии или ВЭЖХ), SDS-PAGE и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) . [2]
Вторичную структуру интактного и ПЭГилированного лизоцима можно охарактеризовать с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД) . [4] [7] Спектры КД в диапазоне 189–260 нм с шагом 0,1 нм не показали существенных изменений во вторичной структуре интактного и ПЭГилированного лизоцима. [4] [7]
Ферментативная активность интактного и ПЭГилированного лизоцима может быть оценена с использованием гликоль-хитозана путем реакции 1 мл 0,05% (м/о) гликоль-хитозана в 100 мМ ацетатного буфера с pH 5,5 и 100 мкл интактного или ПЭГилированного белка при 40 °C в течение 30 мин, а затем добавления 2 мл 0,5 М карбоната натрия с 1 мкг феррицианида калия . [12] Смесь немедленно нагревают, кипятят в течение 15 минут и охлаждают для спектрального анализа при 420 нм. [12] Поскольку ферментативная активность гидролиза связи β-1,4-N-ацетилглюкозамина сохранялась после ПЭГилирования, не наблюдалось снижения ферментативной активности при увеличении степени ПЭГилирования. [4]
Измеряя уменьшение мутности M. lysodeikticus путем инкубации его с лизоцимом, можно оценить ферментативную активность . [13] 7,5 мкл 0,1 - 1 мг/мл белков добавляют к 200 мкл M. lysodeikticus при его оптической плотности (ОП) 1,7 AU, и смесь периодически измеряют при 450 нм для расчета скорости реакции. [5] [13] В отличие от результата ферментативной активности гликоль-хитозана, увеличение степени ПЭГилирования снижает ферментативную активность. [4] [5] Это различие в тенденции ферментативной активности может быть связано с ПЭГилированием свободного лизина, вызывающим стерические помехи и впоследствии предотвращающим образование комплекса фермент-субстрат в случае реакции с макромолекулой, такой как M. lysodeikticus. [4] [5] [14]