stringtranslate.com

Колониеобразующая единица

В микробиологии колониеобразующая единица ( КОЕ , КОЕ или Cfu ) — это единица, которая оценивает количество микробных клеток ( бактерий , грибков , вирусов и т. д.) в образце, которые являются жизнеспособными , способными размножаться путем бинарного деления в контролируемых условиях. Подсчет с помощью колониеобразующих единиц требует культивирования микробов и подсчитывает только жизнеспособные клетки, в отличие от микроскопического исследования, которое подсчитывает все клетки, живые или мертвые. Визуальный вид колонии в клеточной культуре требует значительного роста, и при подсчете колоний неизвестно, возникла ли колония из одной клетки или группы клеток. Выражение результатов в виде колониеобразующих единиц отражает эту неопределенность.

Теория

Раствор, приготовленный с использованием бактерий и пептонированной воды, помещают в чашку с агаром ( для пищевых образцов — агар для подсчета колоний на основе агара или триптиказо-соевого агара для клинических образцов) и распределяют по чашке, наклоняя ее в указанном порядке.

Целью чашечного подсчета является оценка количества присутствующих клеток на основе их способности давать начало колониям при определенных условиях температуры, времени и питательной среды. Теоретически, одна жизнеспособная клетка может дать начало колонии путем репликации. Однако одиночные клетки являются исключением в природе, и в большинстве случаев прародителем колонии является масса клеток, отложенных вместе. [1] [2] Кроме того, многие бактерии растут цепочками (например, Streptococcus ) или скоплениями (например, Staphylococcus ). Оценка микробных чисел по КОЕ в большинстве случаев будет занижать количество живых клеток, присутствующих в образце, по этим причинам. Это происходит потому, что подсчет КОЕ предполагает, что каждая колония отделена и основана одной жизнеспособной микробной клеткой. [3]

Подсчет на чашке Петри линейный для E. coli в диапазоне от 30 до 300 КОЕ на чашке Петри стандартного размера . [4] Поэтому, чтобы гарантировать, что образец даст КОЕ в этом диапазоне, требуется разбавление образца и посев нескольких разведений. Обычно используются десятикратные разбавления, а серия разведений высевается в повторностях по 2 или 3 в выбранном диапазоне разведений. Часто высевается 100 мкл, но используются и большие объемы до 1 мл. Более высокие объемы посева увеличивают время сушки, но часто не приводят к более высокой точности, поскольку могут потребоваться дополнительные этапы разбавления. [5] КОЕ/чашка считывается с чашки в линейном диапазоне, а затем КОЕ/г (или КОЕ/мл) оригинала выводится математически, с учетом высеянного количества и его коэффициента разбавления.

Раствор бактерий неизвестной концентрации часто разбавляют последовательно , чтобы получить хотя бы одну пластину с подсчетным числом бактерий. На этом рисунке пластина "x10" подходит для подсчета.

Преимущество этого метода в том, что различные виды микроорганизмов могут образовывать колонии, которые явно отличаются друг от друга как микроскопически , так и макроскопически . Морфология колонии может быть очень полезна для идентификации присутствующего микроорганизма. [6]

Предварительное понимание микроскопической анатомии организма может дать лучшее понимание того, как наблюдаемое КОЕ/мл соотносится с числом жизнеспособных клеток на миллилитр. В качестве альтернативы можно уменьшить среднее число клеток на КОЕ в некоторых случаях путем встряхивания образца перед проведением разбавления. Однако многие микроорганизмы являются хрупкими и будут страдать от снижения доли жизнеспособных клеток при помещении в вортекс. [7]

Запись журнала

Концентрации колониеобразующих единиц можно выразить с помощью логарифмической записи, где показанное значение представляет собой десятичный логарифм концентрации. [8] [9] [10] Это позволяет вычислить логарифмическое уменьшение процесса дезактивации как простое вычитание.

Использует

Колониеобразующие единицы используются для количественной оценки результатов во многих микробиологических методах посева и подсчета, включая:

Однако при использовании методов, требующих использования агаровой пластины, нельзя использовать жидкий раствор, поскольку чистота образца не может быть неопределенной, и невозможно подсчитать клетки по одной в жидкости. [13]

Инструменты для подсчета колоний

Традиционный способ подсчета КОЕ с помощью «щелчкового счетчика» и ручки. Когда колоний слишком много, общепринятой практикой является подсчет КОЕ только на части чашки.

Подсчет колоний традиционно выполняется вручную с помощью ручки и счетчика щелчков. Это, как правило, простая задача, но может стать очень трудоемкой и отнимающей много времени, когда нужно подсчитать много чашек. В качестве альтернативы можно использовать полуавтоматические (программное обеспечение) и автоматические (аппаратное обеспечение + программное обеспечение) решения. [14] [15] [16]

Программное обеспечение для подсчета КОЕ

Колонии можно подсчитать по фотографиям чашек с помощью программных инструментов. Экспериментаторы обычно фотографируют каждую чашку, которую им нужно подсчитать, а затем анализируют все фотографии (это можно сделать с помощью простой цифровой камеры или даже веб-камеры). Поскольку на создание одной фотографии уходит менее 10 секунд, в отличие от нескольких минут для ручного подсчета КОЕ, такой подход обычно экономит много времени. Кроме того, он более объективен и позволяет извлекать другие переменные, такие как размер и цвет колоний. [16]

В дополнение к программному обеспечению на основе традиционных настольных компьютеров, приложения для устройств Android и iOS доступны для полуавтоматического и автоматизированного подсчета колоний. Интегрированная камера используется для фотографирования агаровой пластины, а внутренний или внешний алгоритм используется для обработки данных изображения и оценки количества колоний. [21] [22] [23]

Автоматизированные системы

Многие из автоматизированных систем используются для противодействия человеческим ошибкам , поскольку многие исследовательские методы, применяемые людьми для подсчета отдельных клеток, имеют высокую вероятность ошибки. В связи с тем, что исследователи регулярно вручную подсчитывают клетки с помощью проходящего света, эта подверженная ошибкам техника может оказать значительное влияние на расчетную концентрацию в основной жидкой среде, когда клетки находятся в небольшом количестве. [24]

Автоматический счетчик колоний с использованием обработки изображений.

Полностью автоматизированные системы также доступны у некоторых производителей биотехнологий. [25] [26] Они, как правило, дороги и не так гибки, как автономное программное обеспечение, поскольку аппаратное и программное обеспечение разработаны для совместной работы в определенной настройке. [18] В качестве альтернативы, некоторые автоматические системы используют парадигму спирального посева . [27]

Некоторые автоматизированные системы, такие как системы MATLAB, позволяют подсчитывать клетки без необходимости их окрашивания. Это позволяет повторно использовать колонии для других экспериментов без риска уничтожения микроорганизмов красителями. Однако недостатком этих автоматизированных систем является то, что крайне сложно отличить микроорганизмы от пыли или царапин на пластинах кровяного агара, поскольку и пыль, и царапины могут создавать весьма разнообразную комбинацию форм и внешнего вида. [28]

Альтернативные единицы

Вместо колониеобразующих единиц можно использовать параметры наиболее вероятного числа (MPN) и модифицированных единиц Фишмана (MFU) [29] . Метод наиболее вероятного числа подсчитывает жизнеспособные клетки и полезен при подсчете низких концентраций клеток или подсчете микробов в продуктах, где частицы делают подсчет на пластине нецелесообразным. [30] Модифицированные единицы Фишмана учитывают бактерии, которые жизнеспособны, но не поддаются культивированию.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Аманн, RI; Людвиг, W; Шлейфер, KH (1995). «Филогенетическая идентификация и обнаружение in situ отдельных микробных клеток без культивирования». Microbiological Reviews . 59 (1): 143–169. doi :10.1128/mr.59.1.143-169.1995. ISSN  0146-0749. PMC  239358 . PMID  7535888.
  2. ^ Стэйли, Джеймс Т.; Конопка, Аллан (1985). «Измерение in situ активности нефотосинтетических микроорганизмов в водных и наземных местообитаниях». Annual Review of Microbiology . 39 (1): 321–346. doi :10.1146/annurev.mi.39.100185.001541. ISSN  0066-4227. PMID  3904603.
  3. ^ Goldman, Emanuel; Green, Lorrence H (24 августа 2008 г.). Practical Handbook of Microbiology, Second Edition (Google eBook) (Второе изд.). США: CRC Press, Taylor and Francis Group. стр. 864. ISBN 978-0-8493-9365-5. Получено 16 октября 2014 г. .
  4. ^ Брид, RS; Доттеррер, WD (май 1916). «Количество колоний, допустимое на удовлетворительных агаровых пластинах». Журнал бактериологии . 1 (3): 321–31. doi : 10.1128/JB.1.3.321-331.1916. PMC 378655. PMID  16558698. 
  5. ^ Schug, Angela R.; Bartel, Alexander; Meurer, Marita; Scholtzek, Anissa D.; Brombach, Julian; Hensel, Vivian; Fanning, Séamus; Schwarz, Stefan; Feßler, Andrea T. (1 декабря 2020 г.). «Сравнение двух методов определения количества клеток в ходе тестирования восприимчивости к биоцидам». Ветеринарная микробиология . 251 : 108831. doi : 10.1016/j.vetmic.2020.108831. PMID  33202368. S2CID  225308316.
  6. ^ Бадиян, Саидесадат; Дилмагани-Маранд, Арезу; Хаджипур, Мохаммад Джавад; Амери, Али; Раззаги, Мохаммад Реза; Рафии-Табар, Хашем; Махмуди, Мортеза; Сасанпур, Пежман (17 июля 2018 г.). «Обнаружение и дискриминация бактериальных колоний с помощью матричной визуализации Мюллера». Научные отчеты . 8 (1): 10815. doi : 10.1038/s41598-018-29059-5. ISSN  2045-2322. ПМК 6050273 . ПМИД  30018335. 
  7. ^ Фоладори, Паола; Лаура, Бруни; Джанни, Андреоттола; Джулиано, Дзиглио (2007). «Влияние обработки ультразвуком на жизнеспособность бактерий на очистных сооружениях сточных вод, оцененное с помощью проточной цитометрии — фекальные показатели, сточные воды и активированный ил». Water Research . 41 (1): 235–243. doi :10.1016/j.watres.2006.08.021. PMID  17052743.
  8. ^ "Log10 колониеобразующих единиц на грамм". Энциклопедия Titi Tudorancea . Получено 25 сентября 2016 г.
  9. ^ Fung, Daniel YC (2009). "Viable Cell Counts". Bioscience International . Получено 25 сентября 2016 г.
  10. ^ Коул, Мартин (1 ноября 2005 г.). "Принципы микробиологического тестирования: Статистическая основа отбора проб" (PDF) . Международная комиссия по микробиологическим спецификациям для пищевых продуктов (ICMSF). Архивировано из оригинала (PDF) 31 октября 2017 г. . Получено 25 сентября 2016 г. .
  11. ^ abc "USP 61: Тесты по подсчету микроорганизмов". Фармакопея США . Получено 21 мая 2024 г.
  12. ^ Whitmire, Jeannette M.; Merrell, D. Scott (2012), Houghton, JeanMarie (ред.), «Успешные методы культивирования для видов Helicobacter: общие методы культивирования для Helicobacter pylori», Helicobacter Species , Методы в молекулярной биологии, т. 921, Тотова, Нью-Джерси: Humana Press, стр. 17–27, doi : 10.1007/978-1-62703-005-2_4, ISBN 978-1-62703-004-5, PMID  23015487 , получено 1 декабря 2023 г.
  13. ^ Рейнольдс, Джеки. «Протоколы последовательного разбавления». www.microbelibrary.org . Архивировано из оригинала 17 ноября 2015 г. . Получено 15 ноября 2015 г. .
  14. ^ Брюггер, Сильвио Д.; Баумбергер, Кристиан; Йост, Марсель; Дженни, Вернер; Брюггер, Урс; Мюлеманн, Катрин (20 марта 2012 г.). Бересвилл, Стефан (ред.). «Автоматизированный подсчет бактериальных колониеобразующих единиц на чашках с агаром». ПЛОС ОДИН . 7 (3): e33695. Бибкод : 2012PLoSO...733695B. дои : 10.1371/journal.pone.0033695 . ISSN  1932-6203. ПМК 3308999 . ПМИД  22448267. 
  15. ^ Хан, Ариф уль Маула; Торелли, Анджело; Вольф, Иво; Гретц, Норберт (8 мая 2018 г.). «AutoCellSeg: надежный автоматический анализ колониеобразующих единиц (КОЕ)/клеток с использованием адаптивной сегментации изображений и простых в использовании методов постредактирования». Scientific Reports . 8 (1): 7302. doi :10.1038/s41598-018-24916-9. ISSN  2045-2322. PMC 5940850 . PMID  29739959. 
  16. ^ ab Zhang, Louis (5 ноября 2022 г.). «Машинное обучение для подсчета единиц формирования колоний клеток». Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art . 5 (1): 26. doi : 10.1186/s42492-022-00122-3 . ISSN  2524-4442. PMC 9637067. PMID 36334176  . 
  17. ^ Гейсманн, Квентин (2013). «OpenCFU, новое бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для подсчета колоний клеток и других круглых объектов». PLOS ONE . ​​8 (2): e54072. arXiv : 1210.5502 . Bibcode :2013PLoSO...854072G. doi : 10.1371/journal.pone.0054072 . PMC 3574151 . PMID  23457446. 
  18. ^ ab Clarke, Matthew L.; Burton, Robert L.; Hill, A. Nayo; Litorja, Maritoni; Nahm, Moon H.; Hwang, Jeeseong (август 2010 г.). «Недорогой, высокопроизводительный, автоматизированный подсчет бактериальных колоний». Цитометрия, часть A. 77 ( 8): 790–797. doi :10.1002/cyto.a.20864. PMC 2909336. PMID  20140968 . 
  19. ^ Cai, Zhongli; Chattopadhyay, Niladri; Liu, Wenchao Jessica; Chan, Conrad; Pignol, Jean-Philippe; Reilly, Raymond M. (ноябрь 2011 г.). «Оптимизированный цифровой подсчет колоний клоногенных анализов с использованием программного обеспечения ImageJ и настраиваемых макросов: сравнение с ручным подсчетом». International Journal of Radiation Biology . 87 (11): 1135–1146. doi :10.3109/09553002.2011.622033. PMID  21913819. S2CID  25417288.
  20. ^ Брей, Марк-Энтони; Воукс, Марта С.; Карпентер, Энн Э. (январь 2015 г.). «Использование CellProfiler для автоматической идентификации и измерения биологических объектов на изображениях». Current Protocols in Molecular Biology . 109 (1): 14.17.1–14.17.13. doi :10.1002/0471142727.mb1417s109. PMC 4302752. PMID  25559103 . 
  21. ^ Ардуэнго, Микеле (29 марта 2013 г.). «Теперь доступно для покупки: приложение Promega Colony Counter». Promega Connections .
  22. ^ Мука, ​​Майкл; Мюгг, Вероника; Шлоттербек, Анн-Катрин; Штегер, Лоран; Генш, Александр; Хеллер, Стефани; Эгли, Адриан (август 2022 г.). «Работа четырех приложений для подсчета бактериальных клеток на смартфонах». Журнал микробиологических методов . 199 : 106508. doi : 10.1016/j.mimet.2022.106508 . ПМИД  35691441.
  23. ^ Аустерйост, Йонас; Марквард, Даниэль; Раддац, Лукас; Гейер, Доминик; Беккер, Томас; Шепер, Томас; Линднер, Патрик; Бейтель, Саша (август 2017 г.). «Приложение для интеллектуальных устройств для автоматизированного определения колоний E. coli на агаровых пластинах». Engineering in Life Sciences . 17 (8): 959–966. doi : 10.1002/elsc.201700056 . ISSN  1618-0240. PMC 6999497 . PMID  32624845. 
  24. ^ Джарвис, Бэзил (2016). «Ошибки, связанные с процедурами подсчета колоний». Статистические аспекты микробиологического исследования пищевых продуктов . Elsevier: 119–140. doi :10.1016/b978-0-12-803973-1.00007-3. ISBN 978-0-12-803973-1.
  25. ^ Хойзер, Элиза; Беккер, Карстен; Иделевич, Евгений А. (17 августа 2023 г.). «Оценка автоматизированной системы подсчета микробных колоний». Microbiology Spectrum . 11 (4): e00673-23. doi :10.1128/spectrum.00673-23. PMC 10433998. PMID 37395656  . 
  26. ^ "Полностью автоматический счетчик колоний от AAA Lab Equipment Video". LabTube . 7 августа 2015 г. Получено 28 сентября 2018 г.
  27. ^ Gilchrist, JE; Campbell, JE; Donnelly, CB; Peeler, JT; Delaney, JM (1973). «Метод спиральной пластины для определения бактерий». Applied Microbiology . 25 (2): 244–252. doi :10.1128/am.25.2.244-252.1973. ISSN  0003-6919. PMC 380780 . PMID  4632851. 
  28. ^ Brugger, Silvio D.; Baumberger, Christian; Jost, Marcel; Jenni, Werner; Brugger, Urs; Mühlemann, Kathrin (20 марта 2012 г.). "Автоматизированный подсчет бактериальных колониеобразующих единиц на агаровых пластинах". PLOS ONE . 7 (3): e33695. Bibcode : 2012PLoSO...733695B. doi : 10.1371/journal.pone.0033695 . ISSN  1932-6203. PMC 3308999. PMID 22448267  . 
  29. ^ Dehority, BA; Tirabasso, PA; Grifo, AP (1989). «Процедуры наиболее вероятного числа для подсчета бактерий рубца, включая одновременную оценку общего и целлюлолитического числа в одной среде». Applied and Environmental Microbiology . 55 (11): 2789–2792. doi :10.1128/aem.55.11.2789-2792.1989. ISSN  0099-2240. PMC 203169 . PMID  2624460. 
  30. ^ Блоджетт, Роберт (октябрь 2010 г.). «Руководство по бактериальному анализу: наиболее вероятное число из последовательных разведений». Управление по контролю за продуктами и лекарствами США .

Дальнейшее чтение