Рамановская микроскопия — это лазерное микроскопическое устройство, используемое для проведения Рамановской спектроскопии . [1] Термин MOLE (лазерный исследователь молекулярной оптики) используется для обозначения рамановской микрозондовой системы. [1] Используемая техника названа в честь К. В. Рамана , который открыл рассеивающие свойства в жидкостях. [2]
Рамановская микроскопия начинается со стандартного оптического микроскопа и добавляет возбуждающий лазер , лазерные режекторные фильтры , спектрометр или монохроматор и оптически чувствительный детектор , такой как прибор с зарядовой связью (ПЗС) или фотоумножительная трубка (ФЭУ). Традиционно Рамановская микроскопия использовалась для измерения Рамановского спектра точки на образце, в последнее время эта техника была расширена для внедрения Рамановской спектроскопии для прямой химической визуализации по всему полю зрения на трехмерном образце.
При прямой визуализации все поле зрения исследуется на предмет рассеяния в небольшом диапазоне волновых чисел (рамановские сдвиги). Например, волновое число, характерное для холестерина, может использоваться для регистрации распределения холестерина в клеточной культуре. Другой подход — гиперспектральная визуализация или химическая визуализация , при которой тысячи спектров Рамана собираются по всему полю зрения. Затем данные можно использовать для создания изображений, показывающих местоположение и количество различных компонентов. Если взять пример с клеточной культурой, гиперспектральное изображение может показать распределение холестерина [3] , а также белков, нуклеиновых кислот и жирных кислот. [4] [5] [6] Можно использовать сложные методы обработки сигналов и изображений, чтобы игнорировать присутствие воды, питательных сред, буферов и других помех.
Рамановская микроскопия, и в частности конфокальная микроскопия , может достигать поперечного пространственного разрешения до субмикрометра. [7] Поскольку рамановский микроскоп является системой с дифракционным ограничением , его пространственное разрешение зависит от длины волны света и числовой апертуры фокусирующего элемента. В конфокальной рамановской микроскопии диаметр конфокальной апертуры является дополнительным фактором. Как правило, поперечное пространственное разрешение может достигать приблизительно длины волны лазера при использовании воздушных объективных линз, в то время как масляные или водные иммерсионные объективы могут обеспечивать поперечное разрешение около половины длины волны лазера. Это означает, что при работе в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне рамановский микроскоп может достигать поперечного разрешения приблизительно от 1 мкм до 250 нм, в то время как глубинное разрешение (если не ограничено оптической глубиной проникновения образца) может варьироваться от 1 до 6 мкм с наименьшей апертурой конфокального отверстия до десятков микрометров при работе без конфокального отверстия. [8] [9] [10] Поскольку объективные линзы микроскопов фокусируют лазерный луч до микрометрового диапазона, результирующий поток фотонов намного выше, чем достигается в обычных рамановских установках. Это имеет дополнительный эффект повышенного фотообесцвечивания молекул, испускающих интерферирующую флуоресценцию. Однако высокий поток фотонов также может вызвать деградацию образца, и поэтому для каждого типа образца необходимо тщательно выбирать длину волны лазера и мощность лазера.
Другим инструментом, который становится все более популярным, является глобальная рамановская визуализация. Эта техника используется для характеристики крупномасштабных устройств, картирования различных соединений и изучения динамики. Она уже использовалась для характеристики графеновых слоев , [ 11] J-агрегированных красителей внутри углеродных нанотрубок и множества других 2D-материалов, таких как MoS2 [12] и WSe2 . Поскольку возбуждающий луч рассеивается по всему полю зрения, эти измерения можно проводить, не повреждая образец. Используя рамановскую микроспектроскопию, можно измерять in vivo спектры рамановского рассеяния с временным и пространственным разрешением микроскопических областей образцов. В результате можно удалить флуоресценцию воды, сред и буферов. Следовательно, она подходит для исследования белков, клеток и органелл.
Рамановская микроскопия для биологических и медицинских образцов обычно использует лазеры ближнего инфракрасного (БИК) диапазона ( особенно распространены диоды 785 нм и 1064 нм Nd:YAG ). Это снижает риск повреждения образца за счет применения более высоких длин волн энергии. Однако интенсивность ближнего ИК-рассеяния мала (из-за зависимости интенсивности рамановского рассеяния от ω 4 ), и большинству детекторов требуется очень длительное время сбора. В последнее время стали доступны более чувствительные детекторы, что делает эту технику более подходящей для общего использования. Рамановская микроскопия неорганических образцов, таких как горные породы, керамика и полимеры, [13] может использовать более широкий диапазон длин волн возбуждения.
Схожая технология, рамановская спектроскопия с усилением с помощью зонда , позволяет получать гиперспектральные изображения высокого разрешения отдельных молекул [14] и ДНК. [15]
Конфокальная Рамановская микроскопия может быть объединена с многочисленными другими методами микроскопии. Используя различные методы и коррелируя данные, пользователь достигает более полного понимания образца. Распространенными примерами методов корреляционной микроскопии являются Рамановская АСМ , [16] [13] Рамановская СБОМ , [17] и Рамановская СЭМ . [18]
Корреляционная SEM-Raman визуализация представляет собой интеграцию конфокального рамановского микроскопа в камеру SEM, что позволяет проводить коррелятивную визуализацию нескольких методов, таких как SE, BSE, EDX , EBSD , EBIC , CL , AFM . [19] Образец помещается в вакуумную камеру электронного микроскопа. Затем оба метода анализа выполняются автоматически в одном и том же месте образца. Полученные SEM и Raman изображения затем могут быть наложены друг на друга. [20] [21] Более того, добавление сфокусированного ионного пучка (FIB) в камеру позволяет удалять материал и, следовательно, получать трехмерное изображение образца. Режим низкого вакуума позволяет проводить анализ на биологических и непроводящих образцах.
Используя рамановскую микроспектроскопию, можно измерить in vivo спектры Рамана с временным и пространственным разрешением микроскопических областей образцов. Отбор проб неразрушающий, а вода, среды и буферы обычно не мешают анализу. Следовательно, in vivo спектроскопия Рамана с временным и пространственным разрешением подходит для исследования белков , клеток и органов . В области микробиологии конфокальная рамановская микроспектроскопия использовалась для картирования внутриклеточного распределения макромолекул, таких как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, а также полимерных включений, таких как поли-β-гидроксимасляная кислота и полифосфаты в бактериях и стерины в микроводорослях. Объединение экспериментов по стабильному изотопному зондированию (SIP) с конфокальной рамановской микроспектроскопией позволило определить скорости ассимиляции 13 C и 15 N-субстратов, а также D 2 O отдельными бактериальными клетками. [22]