Секретомика — это тип протеомики , который включает анализ секретома — всех секретируемых белков клетки, ткани или организма. [1] Секретируемые белки участвуют в различных физиологических процессах, включая клеточную сигнализацию и ремоделирование матрикса , но также являются неотъемлемой частью инвазии и метастазирования злокачественных клеток . [2] Таким образом, секретомика особенно важна для открытия биомаркеров рака [3] и понимания молекулярных основ патогенеза. [4] [5] Анализ нерастворимой фракции секретома ( внеклеточного матрикса ) был назван матрисомикой. [6]
В 2000 году Тьялсма и др. ввели термин «секретом» в своем исследовании эубактерии B. subtilis . Они определили секретом как все секретируемые белки и секреторный аппарат бактерий. Используя базу данных белковых последовательностей B. subtilis и алгоритм, который рассматривал сайты расщепления и аминоконцевые сигнальные пептиды, характерные для секретируемых белков, они смогли предсказать, какая часть протеома секретируется клеткой. [7] В 2001 году та же лаборатория установила стандарт секретомики — предсказания, основанные только на аминокислотной последовательности, недостаточны для определения секретома. Они использовали двумерный гель-электрофорез и масс-спектрометрию для идентификации 82 белков, секретируемых B. subtilis , только 48 из которых были предсказаны с использованием метода, основанного на геноме , из их предыдущей статьи. [8] Это демонстрирует необходимость проверки белков предсказанных результатов.
Поскольку была выявлена сложная природа секреторных путей, а именно, что существует множество неклассических путей секреции и множество несекретируемых белков, которые являются частью классического секреторного пути, возникла необходимость в более глубоком определении секретома. В 2010 году Агравал и др. предложили определить секретом как «глобальную группу секретируемых белков во внеклеточное пространство клеткой, тканью, органом или организмом в любое заданное время и при любых условиях посредством известных и неизвестных секреторных механизмов, включающих конститутивные и регулируемые секреторные органеллы». [9]
В культуре клетки окружены загрязняющими веществами. Бычья сыворотка из клеточной культуральной среды и клеточный дебрис могут загрязнять коллекцию секретируемых белков, используемых для анализа. Бычьи загрязняющие вещества представляют особую проблему, поскольку белковые последовательности многих бычьих внеклеточных белков, таких как фибронектин и фибулин-1 , похожи на человеческие белковые последовательности. [1] Чтобы удалить эти загрязняющие вещества, клетки можно промыть PBS или бессывороточной средой (SFM) перед инкубацией в SFM и сбором секретируемых белков. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не разорвать клетки, высвобождая внутриклеточные белки. [1] Кроме того, время и условия инкубации должны быть оптимизированы таким образом, чтобы метаболический стресс, который может быть вызван недостатком питательных веществ в SFM, не повлиял на секретомный анализ. [10]
Некоторые белки секретируются в небольшом количестве, а затем разбавляются в среде клеточной культуры или в жидкости организма, что затрудняет обнаружение и анализ этих белков. Можно использовать методы концентрирования, такие как осаждение ТХУ [10] , а также высокочувствительные методы, такие как микрочипы антител , которые могут обнаруживать даже отдельные молекулы белка. [11]
Многие секретомные исследования проводятся in vitro с использованием методов культивирования клеток, но неясно, секретируются ли те же самые белки in vivo . Все больше исследований, особенно тех, которые изучают секретом рака, используют методы in vivo для подтверждения релевантности результатов, полученных in vitro . Например, проксимальные биологические жидкости можно собирать рядом с опухолью, чтобы провести секретомный анализ. [1]
Многие секретируемые белки имеют N-концевую пептидную последовательность, которая сигнализирует транслируемому белку о перемещении в эндоплазматический ретикулум , где происходит процессинг, который в конечном итоге приведет к секреции. Наличие этих сигнальных пептидов может быть использовано для предсказания секретома клетки. [1] Некоторые секретируемые белки не имеют классических сигнальных пептидных последовательностей. Они называются «секреторными белками без лидера» (LSP).
Методы прогнозирования по всему геному имеют ряд проблем. Существует высокая вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Кроме того, экспрессия генов сильно зависит от условий окружающей среды, что означает, что секретом, предсказанный по геному или библиотеке кДНК , вряд ли будет полностью соответствовать истинному секретому. [9] Для проверки любых предсказанных секретируемых белков необходимы протеомные подходы.
Несколько баз данных или баз знаний по геному-секретому доступны на основе как курирования, так и вычислительного прогнозирования. Эти базы данных включают базу данных грибкового секретома (FSD), базу знаний грибкового секретома (FunSecKB) [12] и базу данных молочнокислых бактерий-секретомов [13] . Недавно также были выпущены база данных субклеточного расположения белков человека и животных (MetaSecKB) и база данных субклеточного протеома протистов (ProtSecKB). Хотя в вычислительном прогнозировании есть некоторые неточности, эти базы данных предоставляют полезные ресурсы для дальнейшей характеристики субклеточного расположения белков.
Масс-спектрометрический анализ является неотъемлемой частью секретомики. Сыворотка или супернатант, содержащие секретируемые белки, расщепляются протеазой , а белки разделяются с помощью 2D-электрофореза в геле или хроматографических методов. Затем каждый отдельный белок анализируется с помощью масс-спектрометрии, и полученный отпечаток пептидной массы может быть пропущен через базу данных для идентификации белка. [1]
Маркировка стабильными изотопами аминокислот в клеточной культуре (SILAC) стала важным методом в секретомике – она помогает различать секретируемые белки и примеси бычьей сыворотки в клеточной культуре. Супернатант из клеток, выращенных в нормальной среде, и клеток, выращенных в среде с аминокислотами, мечеными стабильными изотопами, смешивают в соотношении 1:1 и анализируют с помощью масс-спектрометрии. Белковые примеси в сыворотке покажут только один пик, поскольку у них нет меченого эквивалента. [1] Например, метод SILAC успешно использовался для различения белков, секретируемых человеческими хондроцитами в культуре, и примесей сыворотки. [14]
Микрочип антител — это высокочувствительный и высокопроизводительный метод обнаружения белка, который недавно стал частью секретомного анализа. Антитела или другой тип связующей молекулы фиксируются на твердой подложке, и добавляется флуоресцентно меченая белковая смесь. Интенсивность сигнала используется для идентификации белков. Микрочипы антител чрезвычайно универсальны — их можно использовать для анализа количества белка в смеси, различных изоформ белка , посттрансляционных модификаций и биохимической активности белков. Кроме того, эти микрочипы высокочувствительны — они могут обнаруживать отдельные молекулы белка. Микрочипы антител в настоящее время используются в основном для анализа образцов человеческой плазмы , но также могут использоваться для культивируемых клеток и секретомики жидкостей организма, представляя собой простой способ поиска присутствия многих белков одновременно. [11]
Помимо того, что они важны для нормальных физиологических процессов, секретируемые белки также играют неотъемлемую роль в опухолеобразовании посредством роста клеток, миграции, инвазии и ангиогенеза , что делает секретомику отличным методом для обнаружения биомаркеров рака. [15] Использование метода протеомики жидкости организма или полной сыворотки для идентификации биомаркеров может быть чрезвычайно сложным — жидкости организма сложны и сильно изменчивы. Секретомический анализ линий раковых клеток или пораженных тканей представляет собой более простую и специфичную альтернативу для обнаружения биомаркеров. [10]
Два основных биологических источника для раковой секретомики — супернатанты раковых клеточных линий и проксимальные биологические жидкости, жидкости, контактирующие с опухолью . Супернатант раковой клеточной линии является привлекательным источником секретируемых белков. Существует множество стандартизированных клеточных линий, и супернатант гораздо проще анализировать, чем проксимальную жидкость организма. Но неясно, является ли секретом клеточной линии хорошим представлением реальной опухоли в ее специфическом микроокружении, и стандартизированная клеточная линия не иллюстрирует гетерогенность реальной опухоли. [15] Анализ проксимальных жидкостей может дать лучшее представление о секретоме человеческой опухоли, но этот метод также имеет свои недостатки. Процедуры сбора проксимальных жидкостей по-прежнему должны быть стандартизированы, и необходимы незлокачественные контроли. Кроме того, экологические и генетические различия между пациентами могут усложнить анализ. [15]
Секретомный анализ обнаружил потенциальные новые биомаркеры во многих типах рака, включая рак легких , рак печени , рак поджелудочной железы , колоректальный рак , рак простаты и рак молочной железы . Простат-специфический антиген (ПСА), текущий стандартный биомаркер рака простаты, имеет низкую диагностическую специфичность — уровни ПСА не всегда могут различать агрессивный и неагрессивный рак — и поэтому необходим более качественный биомаркер. Используя секретомный анализ линий клеток простаты, одно исследование смогло обнаружить несколько белков, обнаруженных в более высоких уровнях в сыворотке больных раком, чем у здоровых лиц. [10]
Также существует большая потребность в биомаркерах для обнаружения рака молочной железы – в настоящее время биомаркеры существуют только для мониторинга поздних стадий рака. [2] Секретомный анализ линий клеток рака молочной железы привел к открытию белка ALCAM как нового биомаркера с многообещающим диагностическим потенциалом. [10]
Анализ человеческого эмбрионального секретома может быть полезен для поиска неинвазивного метода определения жизнеспособности эмбрионов . В ЭКО эмбрионы оцениваются по морфологическим критериям в попытке найти те, которые имеют высокий имплантационный потенциал. Поиск более количественного метода оценки может помочь сократить количество эмбрионов, используемых в ЭКО, тем самым уменьшая количество беременностей более высокого порядка . Например, одно исследование смогло разработать секретомные отпечатки для многих бластоцист и обнаружило 9 белков, которые могли бы различать бластоцисты с нормальным и ненормальным числом хромосом . Этот тип анализа может помочь заменить предимплантационный генетический скрининг (ПГС), который включает биопсию эмбриональных клеток и может быть вредным для развития. [16]