Фаллоидин принадлежит к классу токсинов, называемых фаллотоксинами , которые обнаружены в грибе-смертнике ( Amanita phalloides ) . Это жесткий бициклический гептапептид , который приводит к летальному исходу через несколько дней при попадании в кровоток. Основным симптомом отравления фаллоидином является острый голод из-за разрушения клеток печени. Он действует путем связывания и стабилизации нитевидного актина ( F-актина ) и эффективно предотвращает деполимеризацию актиновых волокон. Благодаря тесному и избирательному связыванию с F-актином производные фаллоидина, содержащие флуоресцентные метки, широко используются в микроскопии для визуализации F-актина в биомедицинских исследованиях.
Фаллоидин был одним из первых открытых циклических пептидов . Он был выделен из гриба смертной шапки и кристаллизован Федором Линеном и Ульрихом Виландом [1] в 1937 году. [2] Его структура необычна тем, что содержит цистеин - триптофановую связь, образующую бициклический гептапептид. Эта связь ранее не была охарактеризована и значительно затрудняет выяснение структуры фаллоидина. Они определили присутствие атома серы с помощью УФ-спектроскопии и обнаружили, что эта кольцевая структура имеет слегка сдвинутую длину волны. Эксперименты с никелем Ренея подтвердили наличие серы в триптофановом кольце. Исследователи обнаружили, что десульфуризированный фаллоидин по-прежнему имеет круглую форму, что продемонстрировало, что структура фаллоидина обычно является бициклической. После линеаризации аминокислотная последовательность десульфурированного фаллоидина была выяснена посредством деградации Эдмана Виландом и Шоном в 1955 году. [3]
Благодаря его высокому сродству к актину ученые обнаружили его потенциальное использование в качестве окрашивающего реагента для эффективной визуализации актина в микроскопии. Производные, конъюгированные с флуорофорами, широко продаются. Благодаря своей способности избирательно связывать нитевидный актин (F-актин), а не мономеры актина (G-актин), флуоресцентно меченный фаллоидин более эффективен, чем антитела против актина. [4]
Фаллоидин представляет собой бициклический гептапептид, содержащий необычную связь цистеин-триптофан. Ген, кодирующий синтез фаллоидина, является частью семейства MSDIN гриба Смертельной шапки и кодирует пропептид из 34 аминокислот. Остаток пролина фланкирует область из семи остатков, которая позже станет фаллоидином. После трансляции пептид должен быть протеолитически вырезан, циклизован, гидроксилирован, сшит Trp-Cys с образованием триптатионина и эпимеризован с образованием D-Thr. Порядок и точный биохимический механизм этих стадий еще полностью не изучены. В настоящее время считается, что необходимые гены биосинтеза сгруппированы рядом с генами MSDIN. [5]
Первой посттрансляционной модификацией 34-мера является протеолитическое расщепление с помощью пролилолигопептидазы (POP) для удаления «лидерного» пептида из 10 аминокислот. Затем POP циклизирует гептапептид Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro путем транспептидации между аминокислотой 1 (Ala) и аминокислотой 7 (Pro). Считается, что затем происходит образование триптатионина посредством сшивания Trp-Cys. [5]
Поскольку фаллоидин используется из-за его способности связывать и стабилизировать полимеры актина, но клетки не могут легко его усвоить, ученые обнаружили, что производные фаллоидина более полезны в исследованиях. По сути, это соответствует типичному синтезу малых пептидов с использованием гидроксил-пролина. Основной трудностью синтеза является образование триптатиониновой связи (цистеин-триптофановая сшивка).
Ниже представлен общий синтетический механизм, реализованный Anderson et al. в 2005 году для твердофазного синтеза ала- 7 -фаллоидина, который по остатку 7 отличается от фаллоидина, как указано ниже. [6] THPP означает тетрагидропиранил-полистироловый линкер, который используется для соединения молекулы с твердой основой во время синтеза. Обратите внимание, что приведенный ниже синтез представляет собой просто общую схему, показывающую порядок образования связей для соединения исходных материалов. Ala 7- фаллоидин, а также многие другие подобные варианты фаллоидина полезны для увеличения поглощения клетками по сравнению с фаллоидином и для прикрепления флуорофора, помогающего визуализировать F-актин в микроскопии.
Первый полный синтез фаллоидина был достигнут посредством сочетания твердофазного и растворофазного синтеза (Baosheng Liu и Jianheng Zhang, патент США, US 8569452 B2). Физические и химические свойства синтетического фаллоидина такие же, как и у природного фаллоидина.
Фаллоидин связывает F- актин , предотвращая его деполимеризацию и отравление клетки. Фаллоидин специфически связывается на границе между субъединицами F-актина, связывая соседние субъединицы вместе. Фаллоидин, бициклический гептапептид, связывается с актиновыми нитями гораздо прочнее, чем с актиновыми мономерами, что приводит к уменьшению константы скорости диссоциации субъединиц актина от концов нитей, что существенно стабилизирует актиновые нити за счет предотвращения деполимеризации нитей. [7] Кроме того, обнаружено, что фаллоидин ингибирует активность гидролиза АТФ F-актина. [8] Таким образом, фаллоидин захватывает мономеры актина в конформацию, отличную от G-актина, и стабилизирует структуру F-актина за счет значительного снижения константы скорости диссоциации мономера, события, связанного с захватом АДФ. [8] В целом обнаружено, что фаллоидин стехиометрически реагирует с актином, сильно способствует полимеризации актина и стабилизирует полимеры актина. [9]
Фаллоидин действует по-разному при различных концентрациях в клетках. При введении в цитоплазму в низких концентрациях фаллоидин рекрутирует менее полимеризованные формы цитоплазматического актина, а также филамин в стабильные «островки» агрегированных полимеров актина, однако он не мешает стрессовым волокнам, т.е. толстым пучкам микрофиламентов. [9] Веланд и др. также отмечает, что при более высоких концентрациях фаллоидин вызывает сокращение клеток. [9]
Вскоре после его открытия ученые вводили фаллоидин мышам и обнаружили, что его ЛД 50 составляет 2 мг/кг при внутрибрюшинной инъекции . При воздействии минимальной смертельной дозы этим мышам потребовалось несколько дней, чтобы умереть. Единственным очевидным побочным эффектом отравления фаллоидином является сильный голод. Это связано с тем, что фаллоидин поглощается печенью только через мембранные транспортные белки желчных солей. [10] Попадая в печень, фаллоидин связывает F-актин, предотвращая его деполимеризацию. Этот процесс требует времени, чтобы разрушить клетки печени. Почки также могут поглощать фаллоидин, но не так эффективно, как печень. Здесь фаллоидин вызывает нефроз. [11]
Свойства фаллоидина делают его полезным инструментом для изучения распределения F-актина в клетках путем мечения фаллоидина флуоресцентными аналогами и использования их для окрашивания актиновых нитей для световой микроскопии. Флуоресцентные производные фаллоидина оказались чрезвычайно полезными для локализации актиновых нитей в живых или фиксированных клетках, а также для визуализации отдельных актиновых нитей in vitro . [7] Была разработана методика высокого разрешения для обнаружения F-актина на световом и электронном микроскопическом уровнях с использованием фаллоидина, конъюгированного с флуорофором эозином , который действует как флуоресцентная метка. [12] В этом методе, известном как флуоресцентное фотоокисление, флуоресцентные молекулы могут использоваться для запуска окисления диаминобензидина (DAB) с образованием продукта реакции, который можно сделать электронно-плотным и обнаружить с помощью электронной микроскопии. [12] Количество визуализируемой флуоресценции можно использовать в качестве количественной меры количества нитчатого актина в клетках, если использовать насыщающие количества флуоресцентного фаллоидина. [7] Следовательно, иммунофлуоресцентная микроскопия наряду с микроинъекцией фаллоидина может быть использована для оценки прямых и непрямых функций цитоплазматического актина на разных стадиях формирования полимера. [9] Таким образом, флуоресцентный фаллоидин может быть использован в качестве важного инструмента при изучении актиновых сетей с высоким разрешением.
Фаллоидин намного меньше антитела, которое обычно используется для мечения клеточных белков для флуоресцентной микроскопии, что позволяет гораздо плотнее маркировать нитчатый актин и получать гораздо более подробные изображения, особенно при более высоком разрешении.
Немодифицированные фаллоидины не проникают через клеточные мембраны, что делает их менее эффективными в экспериментах с живыми клетками. Синтезированы производные фаллоидина со значительно повышенной клеточной проницаемостью.
Клетки, обработанные фаллоидинами, проявляют ряд токсических эффектов и часто погибают. [7] Кроме того, важно отметить, что клетки, обработанные фаллоидином, будут иметь более высокие уровни актина, связанного с их плазматическими мембранами, а микроинъекция фаллоидина в живые клетки изменит распределение актина, а также подвижность клеток. [7]
