Нозерн -блоттинг , или РНК-блоттинг, [1] — это метод, используемый в молекулярно-биологических исследованиях для изучения экспрессии генов путем обнаружения РНК (или изолированной мРНК ) в образце. [2] [3]
С помощью нозерн-блоттинга можно наблюдать клеточный контроль над структурой и функцией, определяя конкретные скорости экспрессии генов во время дифференциации и морфогенеза , а также в аномальных или болезненных состояниях. [4] Нозерн-блоттинг включает использование электрофореза для разделения образцов РНК по размеру и обнаружение с помощью гибридизационного зонда, комплементарного части или всей целевой последовательности. Строго говоря, термин «нозерн-блоттинг» относится конкретно к капиллярному переносу РНК из электрофорезного геля на мембрану для блоттинга. Однако весь процесс обычно называют нозерн-блоттингом. [5] Метод нозерн-блоттинга был разработан в 1977 году Джеймсом Элвайном, Дэвидом Кемпом и Джорджем Старком в Стэнфордском университете . [6] Нозерн-блоттинг получил свое название от его сходства с первым методом блоттинга, Саузерн-блоттингом , названным в честь биолога Эдвина Саузерна . [2] Основное отличие заключается в том, что в нозерн-блоттинге анализируется РНК, а не ДНК . [7]
Общая процедура блоттинга [5] начинается с извлечения общей РНК из гомогенизированного образца ткани или из клеток. Затем эукариотическую мРНК можно выделить с помощью хроматографии на олиго(dT) целлюлозе, чтобы выделить только те РНК, которые имеют поли(A)-хвост . [8] [9] Затем образцы РНК разделяют с помощью гель-электрофореза. Поскольку гели хрупкие, а зонды не способны проникнуть в матрицу, образцы РНК, теперь разделенные по размеру, переносят на нейлоновую мембрану через капиллярную или вакуумную систему блоттинга.
Нейлоновая мембрана с положительным зарядом является наиболее эффективной для использования в нозерн-блоттинге, поскольку отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты имеют высокое сродство к ним. Буфер переноса, используемый для блоттинга, обычно содержит формамид , поскольку он снижает температуру отжига взаимодействия зонда с РНК, тем самым устраняя необходимость в высоких температурах, которые могут вызвать деградацию РНК. [10] После того, как РНК была перенесена на мембрану, она иммобилизуется посредством ковалентной связи с мембраной с помощью УФ-света или тепла. После того, как зонд был помечен, он гибридизуется с РНК на мембране. Экспериментальные условия, которые могут повлиять на эффективность и специфичность гибридизации, включают ионную силу, вязкость, длину дуплекса, несовпадающие пары оснований и состав оснований. [11] Мембрану промывают, чтобы убедиться, что зонд связался специфически, и предотвратить возникновение фоновых сигналов. Затем гибридные сигналы обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки и могут быть количественно определены с помощью денситометрии . Для создания контролей для сравнения в нозерн-блоте можно использовать образцы, не отображающие интересующий генный продукт, после определения с помощью микрочипов или ОТ-ПЦР . [11]
Образцы РНК чаще всего разделяют на агарозных гелях, содержащих формальдегид в качестве денатурирующего агента для РНК, чтобы ограничить вторичную структуру. [11] [12] Гели можно окрашивать бромистым этидием (EtBr) и просматривать в УФ-свете, чтобы наблюдать качество и количество РНК перед блоттингом. [11] Электрофорез в полиакриламидном геле с мочевиной также можно использовать для разделения РНК, но чаще всего он используется для фрагментированной РНК или микроРНК. [13] Лестница РНК часто запускается вместе с образцами на электрофорезном геле, чтобы наблюдать размер полученных фрагментов, но в образцах общей РНК рибосомальные субъединицы могут действовать как маркеры размера. [11] Поскольку большая рибосомальная субъединица — 28S (приблизительно 5 кб), а малая рибосомальная субъединица — 18S (приблизительно 2 кб), на геле появляются две заметные полосы, большая из которых почти в два раза интенсивнее меньшей. [11] [14]
Зонды для нозерн-блоттинга состоят из нуклеиновых кислот с комплементарной последовательностью ко всей или части интересующей РНК. Это могут быть ДНК, РНК или олигонуклеотиды с минимум 25 комплементарными основаниями к целевой последовательности. [5] РНК-зонды (рибозонды), которые транскрибируются in vitro, способны выдерживать более строгие этапы промывки, предотвращая часть фонового шума. [11] Обычно кДНК создается с мечеными праймерами для интересующей последовательности РНК, которая действует как зонд в нозерн-блоте. [15] Зонды должны быть мечены либо радиоактивными изотопами ( 32P ), либо хемилюминесценцией , при которой щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена (HRP) расщепляют хемилюминесцентные субстраты, производя обнаруживаемую эмиссию света. [16] Хемилюминесцентная маркировка может происходить двумя способами: либо зонд прикрепляется к ферменту, либо зонд маркируется лигандом (например, биотином ) , для которого лиганд (например, авидин или стрептавидин ) прикрепляется к ферменту (например, HRP). [11] Рентгеновская пленка может обнаруживать как радиоактивные, так и хемилюминесцентные сигналы, и многие исследователи предпочитают хемилюминесцентные сигналы, поскольку они быстрее, более чувствительны и снижают опасность для здоровья, которая связана с радиоактивными метками. [16] Одну и ту же мембрану можно зондировать до пяти раз без значительной потери целевой РНК. [10]
Нозерн-блоттинг позволяет наблюдать определенный паттерн экспрессии гена между тканями, органами, стадиями развития, уровнями стресса окружающей среды, патогенной инфекцией и в ходе лечения. [9] [15] [17] Этот метод использовался для демонстрации сверхэкспрессии онкогенов и снижения экспрессии генов-супрессоров опухолей в раковых клетках по сравнению с «нормальной» тканью, [11] а также экспрессии гена при отторжении трансплантированных органов. [18] Если повышенная экспрессия гена наблюдается по обилию мРНК на нозерн-блоте, образец затем может быть секвенирован, чтобы определить, известен ли ген исследователям или это новое открытие. [18] Паттерны экспрессии, полученные при заданных условиях, могут дать представление о функции этого гена. Поскольку РНК сначала разделяется по размеру, если используется только один тип зонда, дисперсия в уровне каждой полосы на мембране может дать представление о размере продукта, предполагая альтернативные продукты сплайсинга того же гена или повторяющиеся мотивы последовательности. [8] [14] Разница в размере продукта гена может также указывать на делеции или ошибки в обработке транскрипта. Изменяя цель зонда, используемую вдоль известной последовательности, можно определить, какой регион РНК отсутствует. [2]
Анализ экспрессии генов можно проводить несколькими различными методами, включая ОТ-ПЦР, анализы защиты от РНКазы, микрочипы, РНК-Seq , серийный анализ экспрессии генов (SAGE), а также нозерн-блоттинг. [4] [5] Микрочипы используются довольно часто и обычно согласуются с данными, полученными с помощью нозерн-блоттинга; однако иногда нозерн-блоттинг способен обнаружить небольшие изменения в экспрессии генов, которые микрочипы обнаружить не могут. [19] Преимущество микрочипов перед нозерн-блоттингом заключается в том, что одновременно можно визуализировать тысячи генов, в то время как нозерн-блоттинг обычно рассматривает один или небольшое количество генов. [17] [19]
Проблемой в нозерн-блоттинге часто является деградация образца РНКазами (как эндогенными для образца, так и через загрязнение окружающей среды), чего можно избежать путем надлежащей стерилизации стеклянной посуды и использования ингибиторов РНКаз, таких как DEPC ( диэтилпирокарбонат ). [5] Химические вещества, используемые в большинстве нозерн-блоттингов, могут представлять риск для исследователя, поскольку формальдегид, радиоактивный материал, бромистый этидий, DEPC и УФ-излучение вредны при определенных воздействиях. [11] По сравнению с ОТ-ПЦР нозерн-блоттинг имеет низкую чувствительность, но также высокую специфичность, что важно для снижения ложноположительных результатов. [11]
Преимущества использования нозерн-блоттинга включают определение размера РНК, наблюдение за альтернативными продуктами сплайсинга, использование зондов с частичной гомологией, качество и количество РНК можно измерить на геле перед блоттингом, а мембраны можно хранить и повторно исследовать в течение многих лет после блоттинга. [11]
Для нозерн-блоттинга с целью обнаружения мРНК ацетилхолинэстеразы нерадиоактивный метод сравнивали с радиоактивным и обнаружили, что он столь же чувствителен, как и радиоактивный, но не требует защиты от радиации и занимает меньше времени. [20]
Иногда исследователи используют вариант процедуры, известный как обратный нозерн-блот. В этой процедуре субстратная нуклеиновая кислота (которая прикреплена к мембране) представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК, а зонд — РНК, извлеченную из ткани и радиоактивно меченую. Использование ДНК-микрочипов , которые получили широкое распространение в конце 1990-х и начале 2000-х годов, больше похоже на обратную процедуру, поскольку они включают использование изолированных фрагментов ДНК, прикрепленных к субстрату, и гибридизацию с зондом, изготовленным из клеточной РНК. Таким образом, обратная процедура, хотя изначально и не была распространена, позволила нозерн-анализу развиться в профилирование экспрессии генов , в котором многие (возможно, все) гены в организме могут контролировать свою экспрессию.
