Реакция гемагглютинации или реакция гемагглютинации ( РАГ ) и реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ) были разработаны в 1941–42 годах американским вирусологом Джорджем Херстом как методы количественной оценки относительной концентрации вирусов , бактерий или антител. [ 1]
HA и HAI применяют процесс гемагглютинации , при котором рецепторы сиаловой кислоты на поверхности эритроцитов (эритроцитов) связываются с гликопротеином гемагглютинина, обнаруженным на поверхности вируса гриппа (и нескольких других вирусов), и создают сеть или решетчатую структуру взаимосвязанных эритроцитов и вирусных частиц. [2] Агглютинированная решетка поддерживает эритроциты во взвешенном состоянии, обычно рассматриваемом как диффузный красноватый раствор. Формирование решетки зависит от концентраций вируса и эритроцитов, и когда относительная концентрация вируса слишком низкая, эритроциты не сдерживаются решеткой и оседают на дно лунки. Гемагглютинация наблюдается в присутствии стафилококков, вибрионов и других видов бактерий, аналогично механизму, который вирусы используют для агглютинации эритроцитов. [3] [4] Эритроциты, используемые в анализах HA и HI, обычно берутся от кур, индеек, лошадей, морских свинок или людей в зависимости от селективности целевого вируса или бактерии и связанных с ними поверхностных рецепторов на эритроцитах.
Общая процедура для HA выглядит следующим образом: серийное разведение вируса готовится по рядам в 96-луночном микротитрационном планшете с U- или V-образным дном. [5] Наиболее концентрированный образец в первой лунке часто разбавляется до 1/5 от исходного раствора, а последующие лунки обычно представляют собой двукратные разведения (1/10, 1/20, 1/40 и т. д.). Последняя лунка служит отрицательным контролем без вируса. Каждый ряд планшета обычно имеет другой вирус и одинаковую схему разбавлений. После серийных разведений в каждую лунку добавляется стандартизированная концентрация эритроцитов и осторожно перемешивается. Планшет инкубируется в течение 30 минут при комнатной температуре. После периода инкубации анализ можно проанализировать, чтобы различить агглютинированные и неагглютинированные лунки. Изображения в ряду обычно прогрессируют от агглютинированных лунок с высокой концентрацией вируса и диффузным красноватым видом до серии лунок с низкой концентрацией вируса, содержащих темно-красный осадок или кнопку в центре лунки. Лунки с низкой концентрацией выглядят почти идентично лунке отрицательного контроля без вируса. Вид кнопки возникает из-за того, что эритроциты не удерживаются в агглютинированной решетчатой структуре и оседают в нижней точке лунки с U- или V-образным дном. Переход от агглютинированных к неагглютинированным лункам происходит отчетливо, в пределах 1-2 лунок.
Относительная концентрация или титр образца вируса основывается на лунке с последним агглютинированным проявлением, непосредственно перед тем, как наблюдается осадок. [6] Относительно начальной концентрации вирусного исходного материала концентрация вируса в этой лунке будет некоторым разбавлением исходного материала, например, 1/40-кратным. Значение титра этого образца является обратным разбавлению, т. е. 40. В некоторых случаях вирус изначально настолько разбавлен, что агглютинированные лунки никогда не наблюдаются. В этом случае титр этих образцов обычно назначается как 5, что указывает на максимально возможную концентрацию, но точность этого значения явно низкая. Альтернативно, если относительная концентрация вируса чрезвычайно высока, и лунки никогда не переходят к появлению кнопки. Значение титра тогда обычно назначается как максимальное разбавление, например 5120.
Анализ HI тесно связан с анализом HA, но включает в себя противовирусные антитела в качестве «ингибиторов», препятствующих взаимодействию вируса и эритроцитов. Цель состоит в том, чтобы охарактеризовать концентрацию антител в антисыворотке или других образцах, содержащих антитела. [7] Анализ HI обычно выполняется путем создания серии разведений антисыворотки в рядах 96-луночного микротитрационного планшета. Каждый ряд обычно представляет собой отдельный образец. В каждую лунку добавляется стандартизированное количество вируса или бактерий, и смесь инкубируется при комнатной температуре в течение 30 минут. Последняя лунка в каждом ряду будет отрицательным контролем без добавления вируса. Во время инкубации антитела связываются с вирусными частицами, и если концентрация и связывающая способность антител достаточно высоки, вирусные частицы эффективно блокируются от возникновения гемагглютинации. [8] Затем в каждую лунку добавляется стандартизированное количество эритроцитов и инкубируется при комнатной температуре еще в течение 30 минут. Полученные изображения пластин HI обычно прогрессируют от неагглютинированных, «кнопочных» лунок с высокой концентрацией антител до агглютинированных, красных диффузных лунок с низкой концентрацией антител. Значение титра HI является обратной величиной последнего разведения сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. [9]
Предыдущие описания процессов HA и HI обобщены, и конкретные детали могут различаться в зависимости от оператора и лаборатории. Например, описывается последовательное разбавление по рядам, но некоторые лаборатории используют альтернативную ориентацию и выполняют разбавления вниз по столбцам. Аналогично, начальное разбавление, фактор последовательного разбавления, время инкубации и выбор пластины с U- или V-образным дном могут зависеть от конкретной лаборатории.
HA и HI имеют преимущества в том, что анализы просты, используют относительно недорогие и доступные инструменты и расходные материалы, и дают результаты в течение нескольких часов. Анализы также хорошо зарекомендовали себя во многих лабораториях по всему миру, что позволяет обеспечить некоторую степень достоверности, сравнения и стандартизации. [10] [11]
Оптимальные и надежные результаты требуют контроля нескольких переменных, таких как время инкубации, концентрация эритроцитов и тип эритроцитов. [12] Неспецифические факторы в образце могут привести к помехам и неправильным значениям титра. Например, молекулы в образце, отличные от вирусспецифических антител, могут ингибировать агглютинацию между вирусом и эритроцитами, а также потенциально блокировать связывание антител с вирусом. Рецептор-разрушающие ферменты (RDE) обычно используются для обработки образцов перед анализом, чтобы предотвратить неспецифическое ингибирование. [13] Анализ результатов HA или HI зависит от квалифицированного специалиста, который будет читать планшет и определять значения титра. Метод ручной интерпретации вносит больше возможностей для расхождений в анализ, поскольку результаты могут быть субъективными, а согласие между людьми-считывателями непоследовательно. [14] Кроме того, нет цифровой записи определений планшета или титра, поэтому первоначальная интерпретация утомительна и обычно выполняется в повторах. Диапазон потенциальных переменных и различий между экспертами-читателями может затруднить сравнение результатов, полученных в разных лабораториях. [15]