Микроскопия дифференциально-интерференционного контраста ( DIC ) , также известная как интерференционный контраст Номарского ( NIC ) или микроскопия Номарского , представляет собой метод оптической микроскопии , используемый для повышения контраста в неокрашенных прозрачных образцах . DIC работает по принципу интерферометрии , чтобы получить информацию о длине оптического пути образца и увидеть невидимые в противном случае особенности. Относительно сложная оптическая система создает изображение, в котором объект выглядит от черного до белого на сером фоне. Это изображение похоже на изображение, полученное с помощью фазово-контрастной микроскопии , но без яркого дифракционного ореола. Эту технику изобрел Фрэнсис Хьюз Смит. [1] [ нужна цитата ] «Смит ДИК» был произведен Эрнстом Лейцем Вецларом в Германии и был сложен в производстве. Затем ДИК был развит польским физиком Жоржем Номарским в 1952 году. [2]
ДИК работает путем разделения источника поляризованного света на две ортогонально поляризованные взаимно когерентные части, которые пространственно смещены (сдвинуты) в плоскости образца и повторно объединены перед наблюдением. Интерференция двух частей при рекомбинации чувствительна к их оптической разности путей (т.е. произведению показателя преломления и геометрической длины пути). Добавляя регулируемую фазу смещения, определяющую интерференцию при нулевой разности оптических путей в образце, контраст становится пропорциональным градиенту длины пути вдоль направления сдвига, создавая вид трехмерного физического рельефа, соответствующего изменению оптической плотности образца. образец, подчеркивающий линии и края, но не обеспечивающий топографически точное изображение.
1. Неполяризованный свет попадает в микроскоп и поляризуется под углом 45°.
2. Поляризованный свет попадает в первую призму Волластона , модифицированную Номарским , и разделяется на два луча , поляризованных под углом 90° друг к другу: выборочный и опорный лучи.
3. Два луча фокусируются конденсором для прохождения через образец. Эти два луча сфокусированы таким образом, что они пройдут через две соседние точки образца на расстоянии около 0,2 мкм друг от друга.
4. Лучи проходят через соседние участки образца, разделенные сдвигом. Разделение обычно соответствует разрешению микроскопа. У них будет разная длина оптического пути, если области различаются показателем преломления или толщиной. Это вызывает изменение фазы одного луча относительно другого из-за задержки, которую испытывает волна в более оптически плотном материале.
5. Лучи проходят через объектив и фокусируются на второй призме Волластона, модифицированной Номарским.
6. Вторая призма объединяет два луча в один, поляризованный под углом 135°. Комбинация лучей приводит к интерференции , осветлению или затемнению изображения в этой точке в зависимости от оптической разности путей.
Изображение имеет вид трехмерного объекта при очень наклонном освещении, что приводит к появлению сильных светлых и темных теней на соответствующих гранях. Направление видимого освещения определяется ориентацией призм Волластона.
Как объяснялось выше, изображение генерируется из двух идентичных изображений в светлом поле, наложенных друг на друга с небольшим смещением друг от друга (обычно около 0,2 мкм), и последующей интерференции из-за разности фаз, преобразующей изменения фазы (и, следовательно, длины оптического пути) в видимый перемена в темноте. Это вмешательство может быть как конструктивным, так и деструктивным, приводя к характерному появлению трехмерности.
Типичная разность фаз, вызывающая интерференцию, очень мала и очень редко превышает 90° (четверть длины волны). Это связано с сходством показателей преломления большинства образцов и сред, в которых они находятся: например, клетка в воде имеет разницу показателей преломления всего около 0,05. Эта небольшая разность фаз важна для правильной работы DIC, поскольку, если разность фаз на стыке двух веществ слишком велика, то разность фаз может достигать 180° (половины длины волны), что приводит к полной деструктивной интерференции и аномальной темноте. область, край; если бы разность фаз достигла 360° (полная длина волны), это привело бы к полной конструктивной интерференции, создав аномально яркую область.
Изображение можно аппроксимировать (пренебрегая преломлением и поглощением, обусловленными образцом, а также пределом разрешения разделения лучей) как дифференциалом длины оптического пути относительно положения поперек образца вдоль сдвига, и, таким образом, дифференциалом показателя преломления (оптический плотность) образца.
Контраст можно регулировать с помощью фазы смещения, либо путем перемещения объективной призмы Номарского, либо с помощью волновой пластины лямбда/4 между поляризатором и конденсорной призмой Нормарского (компенсация Де-Сенармона). Результирующий контраст меняется от темного поля при нулевом смещении фазы (интенсивность, пропорциональная квадрату дифференциала сдвига), к типичному рельефу, наблюдаемому для фазы ~ 5–90 градусов, к оптическому окрашиванию на 360 градусов, где длина волны гашения сдвигается с разницей фаз.
При сопоставлении последовательно сдвинутых изображений фазовый сдвиг, вносимый объектом, можно отделить от нежелательных неинтерферометрических артефактов, что обычно приводит к улучшению контрастности, особенно в мутных образцах. [3]
ДИК используется для визуализации живых и неокрашенных биологических образцов, таких как мазки из тканевой культуры или отдельные одноклеточные организмы, переносимые водой. Из-за максимально пространственно некогерентного освещения теоретическое разрешение приближается к теоретическому максимальному охвату, диктуемому сферой Эвальда . [4] Это улучшение методов, требующих более высокой степени когерентности, таких как фазовый контраст .
Одной из небиологических областей, где используется ДИК, является анализ обработки планарных кремниевых полупроводников. Тонкие (обычно 100–1000 нм) пленки при обработке кремния часто в основном прозрачны для видимого света (например, диоксида кремния, нитрида кремния и поликристаллического кремния), а дефекты в них или лежащие поверх них загрязнения становятся более заметными. Это также позволяет определить, является ли элемент ямкой в материале подложки или каплей постороннего материала сверху. Вытравленные кристаллические элементы приобретают особенно яркий вид при ДИК.
Качество изображения при использовании в подходящих условиях является выдающимся по разрешению . Однако анализ изображений ДИК всегда должен учитывать ориентацию призм Волластона и видимое направление освещения, поскольку параллельные им объекты не будут видны. Однако это легко преодолеть, просто вращая образец и наблюдая за изменениями изображения.