Анатоксин-a , также известный как Very Fast Death Factor ( VFDF ), является вторичным бициклическим аминоалкалоидом и цианотоксином с острой нейротоксичностью . Впервые он был обнаружен в начале 1960-х годов в Канаде и был выделен в 1972 году. Токсин вырабатывается несколькими родами цианобактерий и был зарегистрирован в Северной Америке, Южной Америке, Центральной Америке, Европе, Африке, Азии и Океании. Симптомы токсичности анатоксина-a включают потерю координации , мышечные фасцикуляции , судороги и смерть от респираторного паралича . Его способ действия осуществляется через никотиновый ацетилхолиновый рецептор (nAchR), где он имитирует связывание естественного лиганда рецептора , ацетилхолина . Таким образом, анатоксин-a использовался в медицинских целях для исследования заболеваний, характеризующихся низким уровнем ацетилхолина. Из-за своей высокой токсичности и потенциального присутствия в питьевой воде анатоксин-а представляет угрозу для животных, включая людей. Хотя существуют методы обнаружения и очистки воды, ученые призвали к проведению дополнительных исследований для повышения надежности и эффективности. Анатоксин-а не следует путать с гуанитоксином (ранее анатоксин-а(S)), другим мощным цианотоксином, который имеет механизм действия, аналогичный механизму анатоксина-а, и вырабатывается многими из тех же родов цианобактерий, но структурно не связан с ним. [1]
Анатоксин-a был впервые обнаружен П. Р. Горхэмом в начале 1960-х годов после того, как несколько стад крупного рогатого скота погибли в результате употребления воды из озера Саскачеван в Онтарио, Канада, в которой было токсичное цветение водорослей . Он был выделен в 1972 году Дж. П. Девлином из цианобактерий Anabaena flos-aquae . [2]
Анатоксин-а — это нейротоксин, вырабатываемый несколькими родами пресноводных цианобактерий, которые встречаются в водоемах по всему миру. [3] Известно, что некоторые пресноводные цианобактерии являются солеустойчивыми, и поэтому анатоксин-а может быть обнаружен в эстуариях или других соленых средах. [4] Цветение цианобактерий, которые вырабатывают анатоксин-а среди других цианотоксинов, увеличивается в частоте из-за повышения температуры, стратификации и эвтрофикации из-за стока питательных веществ. [5] Эти обширные цианобактериальные вредные цветения водорослей , известные как цианоХАБ, увеличивают количество цианотоксинов в окружающей воде, угрожая здоровью как водных, так и наземных организмов. [6] Некоторые виды цианобактерий, которые вырабатывают анатоксин-а, не вызывают цветения поверхностных вод, а вместо этого образуют бентосные маты. Многие случаи смерти животных, связанные с анатоксином А, произошли из-за проглатывания оторванных бентосных цианобактериальных матов, выброшенных на берег. [7]
Цианобактерии, продуцирующие анатоксин-a, также были обнаружены в почвах и водных растениях. Анатоксин-a хорошо сорбируется на отрицательно заряженных участках в глинистых, богатых органикой почвах и слабо на песчаных почвах. В одном исследовании было обнаружено как связанный, так и свободный анатоксин-a в 38% водных растений, отобранных в 12 водохранилищах Небраски, с гораздо более высокой частотой связанного анатоксина-a, чем свободного. [8]
В 1977 году Кармайкл, Горхэм и Биггс экспериментировали с анатоксином-a. Они ввели токсичные культуры A. flos-aquae в желудки двух молодых телят-самцов и наблюдали, что мышечные фасцикуляции и потеря координации происходили в течение нескольких минут, в то время как смерть из-за дыхательной недостаточности наступала где-то между несколькими минутами и несколькими часами. Они также установили, что длительные периоды искусственного дыхания не позволяли произойти детоксикации и возобновить естественное нервно-мышечное функционирование. Из этих экспериментов они подсчитали, что пероральная минимальная летальная доза (MLD) (водорослей, а не молекулы анатоксина) для телят составляет примерно 420 мг/кг веса тела. [9]
В том же году Девлин и его коллеги открыли бициклическую вторичную аминовую структуру анатоксина-а. Они также провели эксперименты, подобные экспериментам Кармайкла и др. на мышах. Они обнаружили, что анатоксин-а убивает мышей через 2–5 минут после внутрибрюшинной инъекции, которой предшествуют подергивания, мышечные спазмы, паралич и остановка дыхания, отсюда и название «фактор очень быстрой смерти». [10] Они определили LD50 для мышей, которая составляет 250 мкг/кг веса тела. [1]
Электрофизиологические эксперименты, проведенные Спивак и др. (1980) на лягушках, показали, что анатоксин-а является мощным агонистом мышечного типа (α 1 ) 2 βγδ nAChR. Анатоксин-а вызывал деполяризующую нервно-мышечную блокаду, контрактуру прямой мышцы живота лягушки, деполяризацию портняжной мышцы лягушки, десенсибилизацию и изменение потенциала действия. Позднее Томас и др. (1993) в своей работе с куриными субъединицами α 4 β 2 nAChR, экспрессированными на мышиных клетках M 10, и куриными α 7 nAChR, экспрессированными в ооцитах Xenopus laevis , показали, что анатоксин-а также является мощным агонистом нейрональных nAChR. [1]
Лабораторные исследования с использованием мышей показали, что характерные эффекты острого отравления анатоксином-a через внутрибрюшинную инъекцию включают мышечные фасцикуляции , тремор, пошатывание, удушье, паралич дыхания и смерть в течение нескольких минут. У зебровых рыб, подвергшихся воздействию воды, загрязненной анатоксином-a, изменился сердечный ритм. [11]
Были зарегистрированы случаи нелетального отравления у людей, которые пили воду из ручьев и озер, содержащих различные виды цианобактерий, способных вырабатывать анатоксин-а. Последствия нелетального отравления были в основном желудочно-кишечными: тошнота, рвота, диарея и боли в животе. [12] Случай летального отравления был зарегистрирован в Висконсине после того, как подросток прыгнул в пруд, зараженный цианобактериями. [13]
Употребление питьевой воды или рекреационной воды, загрязненной анатоксином-а, может иметь фатальные последствия, поскольку в исследованиях на животных было обнаружено, что анатоксин-а быстро всасывается через желудочно-кишечный тракт. [14] Были зарегистрированы десятки случаев смерти животных из-за употребления в пищу воды из озер или рек, загрязненной анатоксином-а, и предполагается, что это также стало причиной смерти одного человека. [15] Одно исследование показало, что анатоксин-а способен связываться с ацетилхолиновыми рецепторами и вызывать токсические эффекты при концентрациях в наномолярном (нМ) диапазоне при попадании в организм. [16]
Наиболее вероятной формой контакта с цианотоксинами в окружающей среде является дермальное воздействие. Известно, что рекреационное воздействие речных, ручьевых и озерных вод, загрязненных цветением водорослей, вызывает раздражение кожи и сыпь. [17] Первое исследование, в котором изучалось цитотоксическое действие анатоксина-а in vitro на пролиферацию и миграцию клеток кожи человека , показало, что анатоксин-а не оказывал никакого эффекта при 0,1 мкг/мл или 1 мкг/мл, а слабый токсический эффект при 10 мкг/мл проявился только после длительного периода контакта (48 часов). [18]
В настоящее время нет данных о токсичности анатоксина-а при вдыхании, хотя у одного лыжника случился тяжелый респираторный дистресс после того, как он вдохнул брызги воды, содержащие аналогичный цианобактериальный нейротоксин, сакситоксин . [19] Вполне возможно, что вдыхание брызг воды, содержащих анатоксин-а, может иметь схожие последствия.
Анатоксин-а является агонистом как нейрональных α4β2 , так и α4 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, присутствующих в ЦНС, а также (α1 ) 2βγδ мышечных нАХР, которые присутствуют в нервно-мышечных соединениях . [1] (Анатоксин-а имеет сродство к этим рецепторам мышечного типа, которое примерно в 20 раз больше, чем у ацетилхолина . [2] ) Однако цианотоксин мало влияет на мускариновые ацетилхолиновые рецепторы ; он имеет в 100 раз меньшую селективность к этим типам рецепторов, чем к нАХР. [20] Анатоксин-а также проявляет гораздо меньшую активность в ЦНС, чем в нервно-мышечных соединениях. В нейронах гиппокампа и ствола мозга для активации нАХР требовалась концентрация анатоксина-а в 5–10 раз большая, чем в ПНС. [20]
В нормальных условиях ацетилхолин связывается с nAchR в постсинаптической нейрональной мембране, вызывая конформационные изменения во внеклеточном домене рецептора, что в свою очередь открывает пору канала. Это позволяет ионам Na + и Ca2 + перемещаться в нейрон, вызывая деполяризацию клетки и вызывая генерацию потенциалов действия , что позволяет сокращать мышцы. Затем нейротрансмиттер ацетилхолин отделяется от nAchR, где он быстро расщепляется на ацетат и холин ацетилхолинэстеразой . [21]
Связывание анатоксина-a с этими nAchR вызывает те же эффекты в нейронах. Однако связывание анатоксина-a необратимо , и комплекс анатоксина-a nAchR не может быть разрушен ацетилхолинэстеразой . Таким образом, nAchR временно заблокирован в открытом состоянии, что приводит к чрезмерной стимуляции из-за постоянной генерации потенциалов действия. [20]
Два энантиомера анатоксина-а, положительный энантиомер , (+)-анатоксин-а, в 150 раз более эффективен, чем синтетический отрицательный энантиомер, (−)-анатоксин-а. [20] Это происходит потому, что (+)-анатоксин-а, s- цис -еноновая конформация, имеет расстояние 6,0 Å между азотом и карбонильной группой, что хорошо соответствует расстоянию 5,9 Å, которое разделяет азот и кислород в ацетилхолине. [1]
Остановка дыхания , которая приводит к отсутствию поступления кислорода в мозг, является наиболее очевидным и летальным эффектом анатоксина-а. [20] Инъекции мышам, крысам, птицам, собакам и телятам смертельных доз анатоксина-а продемонстрировали, что смерти предшествует последовательность мышечных фасцикуляций , снижение подвижности, коллапс, преувеличенное брюшное дыхание, цианоз и судороги . [2] У мышей анатоксин-а также серьезно влиял на артериальное давление и частоту сердечных сокращений и вызывал тяжелый ацидоз . [1]
С момента его открытия было зарегистрировано множество случаев гибели диких животных и скота из-за анатоксина-а. Смерть домашних собак из-за цианотоксина, определенная по анализу содержимого желудка, наблюдалась на нижнем Северном острове в Новой Зеландии в 2005 году [22] , на востоке Франции в 2003 году [23 ], в Калифорнии в Соединенных Штатах в 2002 и 2006 годах [24] , в Шотландии в 1992 году, в Ирландии в 1997 и 2005 годах [2] , в Германии в 2017 [25] и 2020 годах [26]. В каждом случае у собак начинались мышечные судороги в течение нескольких минут, и они умирали в течение нескольких часов. Многочисленные случаи гибели крупного рогатого скота в результате потребления воды, загрязненной цианобактериями, которые вырабатывают анатоксин-а, были зарегистрированы в Соединенных Штатах, Канаде и Финляндии в период с 1980 года по настоящее время. [2]
Особенно интересный случай отравления анатоксином-a произошел с малыми фламинго в озере Богория в Кении . Цианотоксин, который был обнаружен в желудках и фекальных гранулах птиц, убил около 30 000 фламинго во второй половине 1999 года и продолжает ежегодно вызывать массовые смерти, опустошая популяцию фламинго. Токсин попадает в организм птиц через воду, загрязненную сообществами цианобактерий, которые возникают из горячих источников на дне озера. [27]
Первым биологически встречающимся исходным веществом для расширения тропана в анатоксин-а был кокаин , который имеет схожую стереохимию с анатоксином-а. Сначала кокаин преобразуется в эндоизомер циклопропана, который затем фотолитически расщепляется для получения альфа, бета ненасыщенного кетона. С помощью диэтилазодикарбоксилата кетон деметилируется и образуется анатоксин-а. Похожий, более поздний путь синтеза включает получение 2-тропинона из кокаина и обработку продукта этилхлорформиатом с получением бициклического кетона. Этот продукт объединяется с триметилсилилдиазилметаном, органоалюминиевой кислотой Льюиса и триметилсинильным енолом для получения тропинона. Этот метод проходит еще несколько этапов, производя полезные промежуточные продукты, а также анатоксин-а в качестве конечного продукта. [2]
Первый и наиболее широко изученный подход, используемый для синтеза анатоксина-a in vitro, циклизация циклооктена включает 1,5-циклооктадиен в качестве исходного источника. Это исходное вещество реагирует с образованием метиламина и соединяется с бромноватистой кислотой с образованием анатоксина-a. Другой метод, разработанный в той же лаборатории, использует аминоспирт в сочетании с ацетатом ртути (II) и борогидридом натрия. Продукт этой реакции был преобразован в альфа, бета-кетон и окислен этил азодикарбоксилатом с образованием анатоксина-a. [2]
Этот метод получения анатоксина-a был одним из первых, который не использует химерически аналогичное исходное вещество для образования анатоксина. Вместо этого используется рацемическая смесь 3-тропинона с хиральным основанием амида лития и дополнительными реакциями расширения кольца для получения промежуточного кетона. Добавление органокупрата к кетону дает производное енолтрифлата, которое затем лизируется водородом и обрабатывается дезащитным агентом для получения анатоксина-a. Аналогичные стратегии были также разработаны и использованы другими лабораториями. [2]
Циклизация иминий-иона использует несколько различных путей для создания анатоксина-a, но каждый из них производит и прогрессирует с пирролидиновым иминиевым ионом. Основные различия в каждом пути связаны с предшественниками, используемыми для получения иминий-иона, и общим выходом анатоксина-a в конце процесса. Эти отдельные пути включают производство алкилиминийовых солей, ацилиминийовых солей и тозилиминийовых солей. [2]
Эниновый метатезис анатоксина-а включает использование механизма замыкания кольца и является одним из последних достижений в синтезе анатоксина-а. Во всех методах, включающих этот путь, пироглутаминовая кислота используется в качестве исходного материала в сочетании с катализатором Граббса. Подобно иминиевой циклизации, первая попытка синтеза анатоксина-а с использованием этого пути использовала 2,5-цис-пирролидин в качестве промежуточного соединения. [2]
Анатоксин-a синтезируется in vivo в виде Anabaena flos-aquae , [2] , а также в нескольких других родах цианобактерий. Анатоксин-a и родственные химические структуры производятся с использованием ацетата и глутамата. Дальнейшее ферментативное восстановление этих предшественников приводит к образованию анатоксина-a. Гомоанатоксин, похожее химическое вещество, производится Oscillatoria formosa и использует тот же предшественник. Однако гомоанатоксин подвергается метильной добавке с помощью S-аденозил-L-метионина вместо добавления электронов, что приводит к получению похожего аналога. [1] Биосинтетический генный кластер (BGC) для анатоксина-a был описан из Oscillatoria PCC 6506 в 2009 году. [28]
Анатоксин-а нестабилен в воде и других природных условиях, а в присутствии УФ-излучения подвергается фотодеградации , превращаясь в менее токсичные продукты дигидроанатоксин-а и эпоксианатоксин-а. Фотодеградация анатоксина-а зависит от pH и интенсивности солнечного света, но не зависит от кислорода, что указывает на то, что деградация под действием света не достигается посредством процесса фотоокисления. [20]
Исследования показали, что некоторые микроорганизмы способны разлагать анатоксин-а. Исследование, проведенное Кивирантой и коллегами в 1991 году, показало, что бактериальный род Pseudomonas способен разлагать анатоксин-а со скоростью 2–10 мкг/мл в день. [29] Более поздние эксперименты, проведенные Рапалой и коллегами (1994), подтвердили эти результаты. Они сравнили влияние стерилизованных и нестерилизованных осадков на разложение анатоксина-а в течение 22 дней и обнаружили, что по истечении этого времени пробирки со стерилизованными осадками показали схожие уровни анатоксина-а, как и в начале эксперимента, в то время как пробирки с нестерилизованным осадком показали снижение на 25–48%. [20]
Существует две категории методов обнаружения анатоксина-а. Биологические методы включают введение образцов мышам и другим организмам, которые чаще используются в экотоксикологических испытаниях, таким как артемия ( Artemia salina ), личинки пресноводного ракообразного Thamnocephalus platyurus и личинки различных насекомых. Проблемы с этой методологией включают невозможность определить, является ли анатоксин-а или другой нейротоксин причиной смерти. Для такого испытания также необходимы большие объемы материала образца. В дополнение к биологическим методам ученые использовали хроматографию для обнаружения анатоксина-а. Это осложняется быстрой деградацией токсина и отсутствием коммерчески доступных стандартов для анатоксина-а. [20]
Несмотря на относительно низкую частоту анатоксина-а по сравнению с другими цианотоксинами, его высокая токсичность (летальная доза для человека неизвестна, но, по оценкам, составляет менее 5 мг для взрослого мужчины [30] ) означает, что он по-прежнему считается серьезной угрозой для наземных и водных организмов, в первую очередь для скота и людей. Предполагается, что анатоксин-а был причастен к смерти по крайней мере одного человека. [15] Угроза, исходящая от анатоксина-а и других цианотоксинов, увеличивается, поскольку как сток удобрений, приводящий к эвтрофикации в озерах и реках, так и более высокие глобальные температуры способствуют большей частоте и распространенности цветения цианобактерий. [20]
Всемирная организация здравоохранения в 1999 году и Агентство по охране окружающей среды в 2006 году пришли к выводу, что данных о токсичности анатоксина-а недостаточно для установления формального уровня допустимого суточного потребления (TDI), хотя в некоторых местах были введены собственные уровни. [31] [32]
Анатоксин-а не регулируется Законом о безопасной питьевой воде , но штатам разрешено создавать собственные стандарты для загрязняющих веществ, которые не регулируются. В настоящее время четыре штата установили рекомендуемые уровни содержания анатоксина-а в питьевой воде, как показано в таблице ниже. [33] 8 октября 2009 года Агентство по охране окружающей среды опубликовало третий Список кандидатов на загрязняющие вещества для питьевой воды (CCL), в который был включен анатоксин-а (среди других цианотоксинов), что указывает на то, что анатоксин-а может присутствовать в системах общественного водоснабжения, но не регулируется Агентством по охране окружающей среды. Присутствие анатоксина-а в CCL означает, что в будущем его может потребоваться регулировать Агентством по охране окружающей среды в ожидании дополнительной информации о его влиянии на здоровье людей. [34] [31]
В 2008 году в штате Вашингтон был введен рекреационный консультативный уровень для анатоксина-а в размере 1 мкг/л с целью более эффективного управления цветением водорослей в озерах и защиты пользователей от воздействия цветения. [35]
В канадской провинции Квебек максимально допустимое значение содержания анатоксина-а в питьевой воде составляет 3,7 мкг/л. [36]
В Новой Зеландии максимально допустимое значение содержания анатоксина-а в питьевой воде составляет 6 мкг/л. [37]
На данный момент нет официального уровня рекомендаций для анатоксина-а, [38] хотя ученые подсчитали, что уровень 1 мкг л −1 будет достаточно низким. [39] Аналогичным образом, нет официальных рекомендаций относительно тестирования на анатоксин-а. Среди методов снижения риска цианотоксинов, включая анатоксин-а, ученые благосклонно относятся к методам биологической очистки, поскольку они не требуют сложной технологии, требуют минимального обслуживания и имеют низкие эксплуатационные расходы. Было протестировано несколько вариантов биологической очистки специально для анатоксина-а, хотя был идентифицирован вид Pseudomonas , способный биодеградировать анатоксин-а со скоростью 2–10 мкг мл −1 д −1 . Биологический (гранулированный) активированный уголь (БАУ) также был протестирован как метод биодеградации, но неясно, произошла ли биодеградация или анатоксин-а просто адсорбировал активированный уголь. [38] Другие призвали к проведению дополнительных исследований, чтобы узнать больше о том, как эффективно использовать активированный уголь. [40]
Химические методы очистки более распространены при очистке питьевой воды по сравнению с биологической очисткой, и для анатоксина-а было предложено множество процессов. Окислители, такие как перманганат калия , озон и усовершенствованные окислительные процессы ( АОП ), работали над снижением уровня анатоксина-а, но другие, включая фотокатализ, УФ- фотолиз [40] и хлорирование [ 41] , не показали большой эффективности.
Прямое удаление цианобактерий в процессе очистки воды посредством физической обработки (например, мембранной фильтрации ) является еще одним вариантом, поскольку большая часть анатоксина-а содержится внутри клеток, когда цветение растет. Однако анатоксин-а выделяется из цианобактерий в воду, когда они стареют и лизируются, поэтому физическая обработка может не удалить весь присутствующий анатоксин-а. [42] Необходимо провести дополнительные исследования, чтобы найти более надежные и эффективные методы как обнаружения, так и лечения. [40]
Анатоксин-a является очень мощным агонистом никотиновых ацетилхолиновых рецепторов и как таковой был широко изучен в медицинских целях. Он в основном используется в качестве фармакологического зонда для исследования заболеваний, характеризующихся низким уровнем ацетилхолина, таких как мышечная дистрофия , миастения , болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона . Дальнейшие исследования анатоксина-a и других менее мощных аналогов тестируются в качестве возможных замен ацетилхолина. [2]