Структура на поверхности клеток многих архей, обеспечивающая плавательную подвижность
Археллум ( мн. ч .: археелла ; ранее архейный жгутик ) — уникальная структура на поверхности клеток многих архей , которая обеспечивает плавательную подвижность . Археллум состоит из жесткой спиральной нити, прикрепленной к клеточной мембране молекулярным мотором . Этот молекулярный мотор, состоящий из цитозольных, мембранных и псевдопериплазматических белков, отвечает за сборку нити и, после сборки, за ее вращение. Вращение нити приводит в движение клетки архей в жидкой среде, подобно винту лодки . Бактериальным аналогом архееллума является жгутик , который также отвечает за их плавательную подвижность и также может быть сравнен с вращающимся штопором. Хотя движение археелл и жгутиков иногда описывают как «подобное хлысту», это неверно, поскольку только реснички эукариот движутся таким образом. На самом деле даже «жгутик» (слово, происходящее от латинского слова, означающего «кнут») — неправильное название, поскольку бактериальные жгутики также работают как пропеллероподобные структуры.
Ранние исследования «архейных жгутиков» выявили несколько различий между архейлами и жгутиками, хотя эти различия были отклонены как возможная адаптация архейл к экстремальным экологическим условиям, в которых, как было известно, обитали археи. Когда были секвенированы первые геномы архейных организмов , стало очевидно, что археи не кодируют ни один из белков, входящих в состав жгутика, тем самым установив, что система подвижности архей принципиально отличается от системы бактерий. Чтобы подчеркнуть разницу между этими двумя органеллами, в 2012 году было предложено название архейллюм после исследований, которые показали, что он эволюционно и структурно отличается от бактериальных жгутиков и эукариотических ресничек. [1]
Архаеллы эволюционно и структурно связаны с филаментными системами типа IV (TFF). [2] Семейство TFF, по-видимому, произошло от последнего универсального общего предка, от которого оно разделилось на архееллы, пили типа IV, системы секреции типа II и пили Tad. [3]
История
Первые наблюдения того, что сейчас известно как археллум, возможно, имели место более 100 лет назад, даже до идентификации архей. Археи были первоначально идентифицированы в 1977 году Карлом Вёзе и Джорджем Э. Фоксом [4] , а три домена жизни ( эукария , археи и бактерии ) были предложены 10 лет спустя [5] . Также в 1970-х годах впервые было высказано предположение, что белки, составляющие нить археллума, отличаются от тех, которые собираются в нить жгутика, хотя убедительных данных все еще не хватало. В следующем десятилетии стало очевидно, что все изученные до сих пор архееллы обладают некоторыми «странными» особенностями, такими как сильное присутствие гликозилирования в археэллинах (то есть мономерах, которые образуют филамент архееллы), открытие, которое помогло клонировать первых архееллинов. «Странность» археелл была подтверждена в конце 1990-х годов, когда были опубликованы первые последовательности геномов видов архей, а именно Methanocaldococcus jannaschii в 1996 году, Archaeoglobus fulgidus в 1997 году и Pyrococcus horikoshii в 1998 году . [6] [7] [8] Хотя гены архееллинов были идентифицированы во всех этих трех геномах, не удалось идентифицировать ни одного гена, гомологичного тем, которые участвуют в жгутике. Помимо доказательств того, что археллум не связан со жгутиком, именно в это время стали более очевидными сходства между археллами и пилями типа IV (T4P). [9] Одним из наиболее очевидных доказательств того времени было наблюдение, что археллины синтезируются в цитоплазме как пре-белки с сигнальным пептидом, который необходимо расщепить перед их вставкой, предположительно в основании растущей архееллярной нити. Флагеллины, с другой стороны, не синтезируются как пре-белки. Скорее, эти белки синтезируются в зрелом состоянии и перемещаются в просвет жгутиковой нити (которая, следовательно, полая) и собираются на ее кончике. [10] Именно на основе сходства между археллами и пилями типа IV в 1996 году было опубликовано первое предложение о том, как собираются архееллы. [11] Следующее десятилетие ознаменовалось значительным прогрессом в понимании археелл. Был идентифицирован фермент, отвечающий за расщепление сигнального пептида, а также другие гены, считавшиеся частью оперона архей (теперь кластер arl ). [9] [12] Интересно, что именно в этот период архейла из эуриархеи Halobacterium salinarumБыло показано, что он приводится в действие гидролизом АТФ. [13] Хотя сходство между T4P и археями предполагает, что гидролиз АТФ может приводить в действие эту органеллу, это открытие выявило еще одно важное различие между археями и жгутиками, поскольку последние приводятся в действие катионным насосом. [14] В это время также были проведены некоторые из первоначальных исследований хемотаксиса у архей, хотя первоначальные анализы геномов архей уже предполагали, что эти организмы обладают системой хемотаксиса, подобной бактериям. Интересно, что, несмотря на наличие разных моторов, археи и бактерии имеют удивительно похожие хемотаксические механизмы. [15]
В 2010-х годах исследования генных продуктов оперона arl позволили установить функцию многих «вспомогательных» белков археллума, то есть белков, составляющих мотор этой органеллы. За это время удалось определить минимальный набор компонентов, необходимых для зрелого и функционального археллума: архелин (либо один тип, либо несколько), препилинпептидаза, которая отщепляет сигнальный пептид от преархелина, и белки ArlC/D/E/F/G/H/I/J. В типе Crenarchaetoa гены белков ArlC/D/E не обнаружены; вместо этого архееллированные члены этого типа кодируют ArlX, который, как полагают, имеет функцию, схожую с ArlC/D/E. [16] Основываясь на всех накопленных доказательствах уникальной природы архей, в 2012 году Кен Джаррелл и Соня-Верена Альберс предложили называть эту органеллу не «архейными жгутиками», а «архейлой». [1] Несмотря на некоторую первоначальную критику, [17] [18] это название теперь широко принято в научном сообществе, и по состоянию на 6 июня 2021 года поиск в PubMed терминов «архейла» или «архейлюм» выдает больше результатов за последние годы, чем терминов «архейный жгутик» или «архейный жгутик».
Исследования архееллы все еще продолжаются, как в отношении базовой биологии этой органеллы, так и ее экологических ролей и даже потенциальных биотехнологических приложений. Некоторые из вопросов, которые остаются открытыми, это то, как регулируется экспрессия оперона arl , как выглядит моторный комплекс архееллума и какова роль некоторых вспомогательных компонентов архееллума. [9]
Структура
Компоненты
Большинство белков, составляющих археллум, кодируются в одном генетическом локусе. Этот генетический локус содержит 7-13 генов, которые кодируют белки, участвующие либо в сборке, либо в функционировании археллума. [19] Генетический локус содержит гены, кодирующие археллины ( arlA и arlB ) — структурные компоненты филамента — и моторные компоненты ( arlI , arlJ , arlH ). Локус также кодирует другие вспомогательные белки ( arlG , arlF , arlC , arlD , arlE и arl X). ArlX обнаружен только в Crenarchaeota, а ArlCDE (которые могут существовать как отдельные белки или как белки слияния) — в Euryarchaeotes. Считается, что ArlX и ArlCDE имеют схожие функции, и также считается, что неизвестный белок выполняет ту же функцию в Thaumarchaeota.
Оперон архееллума исторически назывался fla (от «flagellum»), но во избежание путаницы с бактериальным жгутиком и для соответствия остальной номенклатуре (архееллум, архееллины) недавно было предложено переименовать его в arl ( гены, связанные с архееллином). [ 12] Следовательно, название генов также отличается (например, flaJ теперь arlJ ). Поэтому в специализированной литературе можно встретить обе номенклатуры, причем с 2018 года все чаще используется номенклатура arl .
Генетический анализ различных архей показал, что каждый из этих компонентов необходим для сборки архееллума. [20] [21] [22] [23] [24] Пептидаза препилина (называемая PibD у кренархеот и ArlK (ранее FlaK) у эуриархеот) необходима для созревания археллинов и, как правило, кодируется в другом месте хромосомы. [25]
Функциональная характеристика была выполнена для ArlI, члена суперсемейства АТФаз системы секреции типа II/IV [26] и PibD/ArlK. [25] [27] [28] ArlI образует гексамер, который гидролизует АТФ и, скорее всего, генерирует энергию для сборки археллума и для его вращения. [29] [30] PibD расщепляет N-конец археллинов до того, как они могут быть собраны. ArlH ( PDB : 2DR3 ) имеет RecA -подобную складчатость и неактивные домены АТФазы. [31] [32] Этот белок является гомологом KaiC, белка, центрального для регуляции циркадного ритма у цианобактерий. Однако эта функция не считается консервативной; скорее, ArlH также демонстрирует аутофосфорилирование, которое, по-видимому, модулирует его взаимодействие с АТФазой ArlI. [33] Несмотря на делецию arlH , приводящую к потере подвижности, что делает этот белок необходимым для архееллации, его роль в моторе архееллума остается неизвестной. ArlI и ArlH взаимодействуют и, возможно, вместе с предсказанным мембранным белком ArlJ, образуют центральный моторный комплекс. У Crenarchaeota этот моторный комплекс может быть окружен каркасом, образованным кольцом, состоящим из ArlX. [34] У Euryarchaeotes криоэлектронные томограммы показывают, что ArlCDE образуют структуру под мотором, возможно, в порядке (сверху вниз) ArlJ-ArlI-ArlH-ArlCDE. [35] ArlF и ArlG, возможно, образуют статор этого комплекса, обеспечивая статическую поверхность, по которой может двигаться ротор, а также прикрепляя мотор к клеточной оболочке, тем самым предотвращая разрыв мембраны из-за вращения архееллы. [36] [37] Структура ArlCDE неизвестна, но было показано, что этот комплекс (или его вариации) связывает аппарат хемотаксиса и архееллум в Haloferax volcanii . [38]
Функциональные аналоги
Несмотря на ограниченное количество доступных в настоящее время сведений о структуре и сборке архееллума, в результате многочисленных исследований становится все более очевидным, что архееллы играют важную роль в различных клеточных процессах в археях. Несмотря на структурные различия с бактериальным жгутиком, основной функцией, приписываемой архееллуму, является плавание в жидкости [24] [39] [40] и полутвердых поверхностях. [41] [42] Увеличение биохимической и биофизической информации еще больше укрепило ранние наблюдения за опосредованным архееллой плаванием в археях. Как и бактериальный жгутик, [43] [44] архееллум также опосредует поверхностное прикрепление и межклеточную коммуникацию. [45] [46] Однако, в отличие от бактериального жгутика, архееллум не показал своей роли в формировании биопленки архей. [47] В архейных биопленках единственная предполагаемая функция на данный момент находится во время фазы рассеивания биопленки, когда архейные клетки покидают сообщество, используя свой архейлум для дальнейшего инициирования следующего раунда формирования биопленки. Также было обнаружено, что архейлум может иметь участок связывания металла. [48]
Ссылки
^ ab Jarrell KF, Albers SV (июль 2012 г.). «Археллум: старая структура подвижности с новым названием». Trends in Microbiology . 20 (7): 307–12. doi :10.1016/j.tim.2012.04.007. PMID 22613456.
^ Berry JL, Pelicic V (январь 2015 г.). «Исключительно широко распространенные наномашины, состоящие из пилинов типа IV: прокариотические швейцарские армейские ножи». FEMS Microbiology Reviews . 39 (1): 134–54. doi :10.1093/femsre/fuu001. PMC 4471445. PMID 25793961 .
^ Denise R, Abby SS, Rocha EP (июль 2019 г.). Beeby M (ред.). «Диверсификация суперсемейства филаментов типа IV в машины для адгезии, секреции белка, поглощения ДНК и подвижности». PLOS Biology . 17 (7): e3000390. doi : 10.1371/journal.pbio.3000390 . PMC 6668835. PMID 31323028 .
^ Woese CR, Fox GE (ноябрь 1977 г.). «Филогенетическая структура прокариотического домена: первичные царства». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (11): 5088–90. Bibcode :1977PNAS...74.5088W. doi : 10.1073/pnas.74.11.5088 . PMC 432104 . PMID 270744.
^ Woese CR, Kandler O, Wheelis ML (июнь 1990 г.). «К естественной системе организмов: предложение для доменов Archaea, Bacteria и Eucarya». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 87 (12): 4576–9. Bibcode : 1990PNAS ...87.4576W. doi : 10.1073/pnas.87.12.4576 . PMC 54159. PMID 2112744.
^ Bult CJ, White O, Olsen GJ, Zhou L, Fleischmann RD, Sutton GG и др. (август 1996 г.). «Полная последовательность генома метаногенной археи Methanococcus jannaschii». Science . 273 (5278): 1058–73. Bibcode :1996Sci...273.1058B. doi :10.1126/science.273.5278.1058. PMID 8688087. S2CID 41481616.
^ Klenk HP, Clayton RA, Tomb JF, White O, Nelson KE, Ketchum KA и др. (ноябрь 1997 г.). «Полная последовательность генома гипертермофильной сульфатредуцирующей археи Archaeoglobus fulgidus». Nature . 390 (6658): 364–70. Bibcode :1997Natur.390..364K. doi : 10.1038/37052 . PMID 9389475. S2CID 83683005.
^ Каварабаяси Ю., Савада М., Хорикава Х., Хайкава Ю., Хино Ю., Ямамото С. и др. (апрель 1998 г.). «Полная последовательность и генная организация генома гипертермофильной архебактерии Pyrococcus horikoshii OT3». Исследования ДНК . 5 (2): 55–76. дои : 10.1093/dnares/5.2.55 . ПМИД 9679194.
^ abc Jarrell KF, Albers SV, Machado J (16 апреля 2021 г.). «Комплексная история подвижности и архееллации у архей». FEMS Microbes . 2 : xtab002. doi : 10.1093/femsmc/xtab002 . PMC 10117864. PMID 37334237 .
^ Macnab RM (ноябрь 2004 г.). «Экспорт жгутикового белка типа III и сборка жгутиков». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research . 1694 (1–3): 207–17. doi :10.1016/j.bbamcr.2004.04.005. PMID 15546667.
^ Jarrell KF, Bayley DP, Kostyukova AS (сентябрь 1996). "Архейный жгутик: уникальная структура подвижности". Journal of Bacteriology . 178 (17): 5057–64. doi :10.1128/jb.178.17.5057-5064.1996. PMC 178298 . PMID 8752319.
^ ab Pohlschroder M, Pfeiffer F, Schulze S, Abdul Halim MF (сентябрь 2018 г.). «Биогенез поверхности архейных клеток». FEMS Microbiology Reviews . 42 (5): 694–717. doi :10.1093/femsre/fuy027. PMC 6098224. PMID 29912330 .
^ Штрайф С., Штаудингер В.Ф., Марван В., Остерхельт Д. (декабрь 2008 г.). «Вращение жгутиков у архей Halobacterium salinarum зависит от АТФ». Журнал молекулярной биологии . 384 (1): 1–8. дои : 10.1016/j.jmb.2008.08.057. ПМИД 18786541.
^ Lai YW, Ridone P, Peralta G, Tanaka MM, Baker MA (январь 2020 г.). Margolin W (ред.). "Эволюция элементов статора роторных прокариотных двигателей". Журнал бактериологии . 202 (3). doi :10.1128/JB.00557-19. PMC 6964736. PMID 31591272 .
^ Quax TE, Albers SV, Pfeiffer F (декабрь 2018 г.). Robinson NP (ред.). «Таксис в археях». Новые темы в науках о жизни . 2 (4): 535–546. doi :10.1042/ETLS20180089. PMC 7289035. PMID 33525831 .
^ ab Albers SV, Jarrell KF (27 января 2015 г.). "Археллум: как плавают археи". Frontiers in Microbiology . 6 : 23. doi : 10.3389/fmicb.2015.00023 . PMC 4307647. PMID 25699024 .
^ Eichler J (ноябрь 2012 г.). «Ответ Джареллу и Альберсу: название говорит само за себя». Trends in Microbiology . 20 (11): 512–3. doi :10.1016/j.tim.2012.08.007. PMID 22944242.
^ Wirth R (ноябрь 2012 г.). «Ответ Джареллу и Альберсу: на семь букв меньше не значит больше». Trends in Microbiology . 20 (11): 511–2. doi :10.1016/j.tim.2012.07.007. PMID 22889944.
^ Ghosh A, Albers SV (январь 2011). «Сборка и функция архейного жгутика». Труды биохимического общества . 39 (1): 64–9. doi :10.1042/BST0390064. PMID 21265748.
^ Patenge N, Berendes A, Engelhardt H, Schuster SC, Oesterhelt D (август 2001 г.). «Кластер генов fla участвует в биогенезе жгутиков Halobacterium salinarum». Молекулярная микробиология . 41 (3): 653–63. doi : 10.1046/j.1365-2958.2001.02542.x . PMID 11532133.
^ Thomas NA, Bardy SL, Jarrell KF (апрель 2001 г.). «Архейный жгутик: другой вид структуры прокариотической подвижности». FEMS Microbiology Reviews . 25 (2): 147–74. doi :10.1111/j.1574-6976.2001.tb00575.x. PMID 11250034.
^ Thomas NA, Mueller S, Klein A, Jarrell KF (ноябрь 2002 г.). «Мутанты в flaI и flaJ архея Methanococcus voltae имеют дефицит сборки жгутика». Molecular Microbiology . 46 (3): 879–87. doi : 10.1046/j.1365-2958.2002.03220.x . PMID 12410843.
^ Chaban B, Ng SY, Kanbe M, Saltzman I, Nimmo G, Aizawa S, Jarrell KF (ноябрь 2007 г.). «Систематический анализ делеций генов fla в опероне жгутиков выявил несколько генов, необходимых для правильной сборки и функционирования жгутиков в архее Methanococcus maripaludis». Молекулярная микробиология . 66 (3): 596–609. doi :10.1111/j.1365-2958.2007.05913.x. PMID 17887963.
^ ab Lassak K, Neiner T, Ghosh A, Klingl A, Wirth R, Albers SV (январь 2012 г.). «Молекулярный анализ жгутика кренархей». Молекулярная микробиология . 83 (1): 110–24. doi :10.1111/j.1365-2958.2011.07916.x. PMID 22081969.
^ ab Bardy SL, Jarrell KF (ноябрь 2003 г.). «Расщепление префлагеллинов сигнальной пептидазой аспарагиновой кислоты необходимо для жгутикообразования у архея Methanococcus voltae». Молекулярная микробиология . 50 (4): 1339–47. doi : 10.1046/j.1365-2958.2003.03758.x . PMID 14622420.
^ Ghosh A, Hartung S, van der Does C, Tainer JA, Albers SV (июль 2011 г.). «Мотор АТФазы жгутиконосцев архей демонстрирует АТФ-зависимую гексамерную сборку и стимуляцию активности специфическим связыванием липидов». The Biochemical Journal . 437 (1): 43–52. doi :10.1042/BJ20110410. PMC 3213642 . PMID 21506936.
^ Bardy SL, Jarrell KF (февраль 2002 г.). «FlaK археона Methanococcus maripaludis обладает префлагеллиновой пептидазной активностью». FEMS Microbiology Letters . 208 (1): 53–9. doi : 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11060.x . PMID 11934494.
^ Szabó Z, Stahl AO, Albers SV, Kissinger JC, Driessen AJ, Pohlschröder M (февраль 2007 г.). «Идентификация разнообразных архейных белков с сигнальными пептидами класса III, расщепляемыми различными архейными препилинпептидазами». Журнал бактериологии . 189 (3): 772–8. doi :10.1128/JB.01547-06. PMC 1797317. PMID 17114255 .
^ Чаудхури П., ван дер Доус К., Альберс С.В. (18 июня 2018 г.). «Характеристика АТФазы FlaI двигательного комплекса Pyrococcus furiosus archaellum и ее взаимодействия между АТФ-связывающим белком FlaH». PeerJ . 6 : e4984. doi : 10.7717/peerj.4984 . PMC 6011876. PMID 29938130 .
^ Reindl S, Ghosh A, Williams GJ, Lassak K, Neiner T, Henche AL и др. (март 2013 г.). «Взгляд на функции FlaI в сборке и подвижности архейных моторов на основе структур, конформаций и генетики». Molecular Cell . 49 (6): 1069–82. doi :10.1016/j.molcel.2013.01.014. PMC 3615136 . PMID 23416110.
^ Chaudhury P, Neiner T, D'Imprima E, Banerjee A, Reindl S, Ghosh A и др. (февраль 2016 г.). «Нуклеотид-зависимое взаимодействие FlaH и FlaI необходимо для сборки и функционирования мотора архееллума». Молекулярная микробиология . 99 (4): 674–85. doi :10.1111/mmi.13260. PMC 5019145. PMID 26508112 .
^ Мещеряков ВА, Вольф М (июнь 2016). «Кристаллическая структура вспомогательного белка жгутика FlaH Methanocaldococcus jannaschii предполагает регуляторную роль в сборке жгутика архей». Protein Science . 25 (6): 1147–55. doi :10.1002/pro.2932. PMC 4941775 . PMID 27060465.
^ де Соуза Мачадо Дж. Н., Воллмар Л., Шимпф Дж., Чаудхури П., Кумария Р., ван дер Доес С. и др. (июль 2021 г.). «Аутофосфорилирование KaiC-подобного белка ArlH ингибирует олигомеризацию и взаимодействие с ArlI, моторной АТФазой археллы». Молекулярная микробиология . 116 (3): 943–956. дои : 10.1111/mmi.14781 . ПМИД 34219289.
^ Banerjee A, Ghosh A, Mills DJ, Kahnt J, Vonck J, Albers SV (декабрь 2012 г.). «FlaX, уникальный компонент археи кренархеи, образует олигомерные кольцевые структуры и взаимодействует с моторной АТФазой FlaI». Журнал биологической химии . 287 (52): 43322–30. doi : 10.1074/jbc.M112.414383 . PMC 3527919. PMID 23129770 .
^ Daum B, Vonck J, Bellack A, Chaudhury P, Reichelt R, Albers SV и др. (июнь 2017 г.). «Структура и организация in situ машин Pyrococcus furiosus archaellum». eLife . 6 : e27470. doi : 10.7554/eLife.27470 . PMC 5517150 . PMID 28653905.
^ Tsai CL, Tripp P, Sivabalasarma S, Zhang C, Rodriguez-Franco M, Wipfler RL и др. (январь 2020 г.). «Структура периплазматического комплекса FlaG-FlaF и его существенная роль в подвижности археелл». Nature Microbiology . 5 (1): 216–225. doi :10.1038/s41564-019-0622-3. PMC 6952060 . PMID 31844299.
^ Banerjee A, Tsai CL, Chaudhury P, Tripp P, Arvai AS, Ishida JP и др. (май 2015 г.). «FlaF — это β-сэндвич-белок, который закрепляет архееллум в оболочке архейной клетки, связывая белок S-слоя». Structure . 23 (5): 863–872. doi :10.1016/j.str.2015.03.001. PMC 4425475 . PMID 25865246.
^ Li Z, Rodriguez-Franco M, Albers SV, Quax TE (сентябрь 2020 г.). «Комплекс переключателя ArlCDE соединяет систему хемотаксиса и архееллум». Молекулярная микробиология . 114 (3): 468–479. doi : 10.1111/mmi.14527. PMC 7534055. PMID 32416640.
^ Alam M, Claviez M, Oesterhelt D, Kessel M (декабрь 1984 г.). «Жгутики и поведение подвижности квадратных бактерий». The EMBO Journal . 3 (12): 2899–903. doi :10.1002/j.1460-2075.1984.tb02229.x. PMC 557786. PMID 6526006 .
^ Herzog B, Wirth R (март 2012). «Плавательное поведение отдельных видов архей». Applied and Environmental Microbiology . 78 (6): 1670–4. Bibcode :2012ApEnM..78.1670H. doi :10.1128/AEM.06723-11. PMC 3298134. PMID 22247169 .
^ Szabó Z, Sani M, Groeneveld M, Zolghadr B, Schelert J, Albers SV, et al. (июнь 2007 г.). «Подвижность и структура жгутиков гипертермоацидофильной археи Sulfolobus solfataricus». Журнал бактериологии . 189 (11): 4305–9. doi :10.1128/JB.00042-07. PMC 1913377. PMID 17416662 .
^ Jarrell KF, Bayley DP, Florian V, Klein A (май 1996). «Выделение и характеристика инсерционных мутаций в генах флагеллина у археи Methanococcus voltae». Молекулярная микробиология . 20 (3): 657–66. doi :10.1046/j.1365-2958.1996.5371058.x. PMID 8736544. S2CID 41663031.
^ Henrichsen J (декабрь 1972 г.). «Транслокация бактериальной поверхности: обзор и классификация». Bacteriological Reviews . 36 (4): 478–503. doi :10.1128/MMBR.36.4.478-503.1972. PMC 408329 . PMID 4631369.