stringtranslate.com

Генный пистолет

Система доставки частиц PDS-1000/He

В генной инженерии генная пушка или система доставки биолистических частиц — это устройство, используемое для доставки экзогенной ДНК ( трансгенов ), РНК или белка в клетки. Покрывая частицы тяжелого металла интересующим геном и запуская эти микроснаряды в клетки с помощью механической силы, можно внедрить интеграцию желаемой генетической информации в нужные клетки. Технику, связанную с такой доставкой ДНК микроснарядами, часто называют биолистикой , сокращенно от «биологической баллистики». [1] [2]

Это устройство способно трансформировать практически любой тип клеток и не ограничивается трансформацией ядра; он также может трансформировать органеллы, включая пластиды и митохондрии . [3]

Генная пушка используется для доставки экзогенной ДНК в клетки. Этот метод известен как «биолистика». Генные пушки можно эффективно использовать на большинстве клеток, но в основном они применяются на растительных клетках.
  1. Генная пушка готова к выстрелу.
  2. Гелий заполняет камеру, и давление на разрывной диск возрастает.
  3. Давление в конечном итоге достигает точки, где разрывной диск разрывается, и возникающий в результате выброс гелия толкает покрытый ДНК/золотом макроноситель («Пластиковый диск») к стопорному экрану.
  4. Когда макроноситель попадает на останавливающий экран, частицы золота, покрытые ДНК, продвигаются через экран в клетки-мишени.

Дизайн генной пушки

Генная пушка изначально представляла собой пневматический пистолет Crosman , модифицированный для стрельбы плотными частицами вольфрама . Он был изобретен Джоном Сэнфордом , Эдом Вольфом и Нельсоном Алленом из Корнелльского университета [4] [5] [6] вместе с Тедом Кляйном из DuPont в период с 1983 по 1986 год. Первоначальной целью был лук (выбранный из-за большого размера клеток). , и устройство использовалось для доставки частиц, покрытых маркерным геном , который передал бы сигнал, если бы произошла правильная вставка транскрипта ДНК. [7] Генетическая трансформация была продемонстрирована при наблюдаемой экспрессии маркерного гена в клетках лука.

В самых ранних генных пушках, изготовленных по индивидуальному заказу (изготовленных Нельсоном Алленом), использовался патрон для гвоздестрельного пистолета 22 калибра , чтобы продвигать полиэтиленовый цилиндр (пулю) вниз по стволу Дугласа 22 калибра. Капля вольфрамового порошка, покрытая генетическим материалом, была помещена на пулю и сброшена в чашку Петри внизу. Пуля приварилась к диску под пластинкой Петри, и генетический материал врезался в образец с эффектом пончика, включающим опустошение в середине образца и кольцо хорошей трансформации по периферии. Пушка была соединена с вакуумным насосом и во время стрельбы находилась под вакуумом. Ранняя конструкция была запущена в ограниченное производство компанией Rumsey-Loomis (местный механический цех на Мекленбург-роуд в Итаке, штат Нью-Йорк, США).

Biolistics, Inc. продала Dupont права на производство и распространение обновленного устройства с улучшениями, включая использование гелия в качестве невзрывоопасного топлива и многодискового механизма доставки столкновений для минимизации повреждения тканей образца. Другие тяжелые металлы, такие как золото и серебро , также используются для доставки генетического материала, причем золото предпочтительнее из-за более низкой цитотоксичности по сравнению с вольфрамовыми носителями снарядов. [8]

Биолистический дизайн конструкции

Биолистическая трансформация включает интеграцию функционального фрагмента ДНК, известного как конструкция ДНК, в клетки-мишени. Генная конструкция представляет собой кассету ДНК, содержащую все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в организме-мишени. [9] [ нужна страница ] Хотя конструкции генов могут различаться по своей конструкции в зависимости от желаемого результата процедуры трансформации, все конструкции обычно содержат комбинацию последовательности промотора , последовательности терминатора , интересующего гена и гена-репортера .

Промоутер
Промоторы контролируют расположение и величину экспрессии генов и действуют как «руль и педаль газа» гена. [9] [ нужна страница ] Промоторы предшествуют интересующему гену в конструкции ДНК и могут быть изменены с помощью лабораторного дизайна для точной настройки экспрессии трансгена. Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты является примером широко используемого промотора, который приводит к устойчивой конститутивной экспрессии генов в растениях. [10]
Терминатор
Последовательности терминатора необходимы для правильной экспрессии гена и располагаются после кодирующей области интересующего гена в конструкции ДНК. Обычным терминатором биолистической трансформации является терминатор NOS, полученный из Agrobacterium tumefaciens . Из-за высокой частоты использования этого терминатора в генно-инженерных растениях были разработаны стратегии обнаружения его присутствия в пищевых продуктах для мониторинга несанкционированных ГМ-культур. [11] [ не удалось проверить ]
Репортерный ген
Ген, кодирующий селектируемый маркер, является общим элементом в конструкциях ДНК и используется для отбора правильно трансформированных клеток. Выбор выбираемого маркера будет зависеть от трансформируемого вида, но обычно это будет ген, наделяющий клетки способностью детоксикации для определенных гербицидов или антибиотиков, таких как канамицин , гигромицин B или глифосат [9] [ нужна страница ] . [12] [13] [14]
Дополнительные элементы
Необязательные компоненты конструкции ДНК включают такие элементы, как последовательности cre-lox , которые позволяют контролируемое удаление конструкции из целевого генома. [15] Такие элементы выбираются разработчиком конструкции для выполнения специализированных функций наряду с основным интересующим геном.

Приложение

Генные пушки в основном используются с растительными клетками. Тем не менее, существует большой потенциал использования для людей и других животных.

Растения

Мишенью генной пушки часто является каллус недифференцированных растительных клеток или группа незрелых эмбрионов, растущих на гелевой среде в чашке Петри. После того, как частицы золота, покрытые ДНК, доставлены в клетки, ДНК используется в качестве матрицы для транскрипции (временная экспрессия), а иногда она интегрируется в хромосому растения («стабильная» трансформация).

Если доставленная конструкция ДНК содержит селектируемый маркер, то стабильно трансформированные клетки можно отбирать и культивировать с использованием методов культуры тканей. Например, если доставленная конструкция ДНК содержит ген, придающий устойчивость к антибиотику или гербициду, то стабильно трансформированные клетки можно отобрать путем включения этого антибиотика или гербицида в среду для культуры ткани.

Трансформированные клетки можно обрабатывать рядом растительных гормонов, таких как ауксины и гиббереллины , и каждый из них может делиться и дифференцироваться в организованные, специализированные тканевые клетки целого растения. Эта способность к полной регенерации называется тотипотентностью . Новое растение, возникшее из успешно трансформированной клетки, может иметь новые наследственные признаки. Использование генной пушки можно противопоставить использованию Agrobacterium tumefaciens и ее Ti-плазмиды для внедрения ДНК в растительные клетки. См. Трансформацию , чтобы узнать о различных методах трансформации у разных видов.

Люди и другие животные

Генные пушки также использовались для доставки ДНК-вакцин .

Доставка плазмид в нейроны крыс с помощью генной пушки, в частности в нейроны DRG, также используется в качестве фармакологического предшественника при изучении последствий нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера .

Генная пушка стала распространенным инструментом для маркировки подмножеств клеток в культивируемых тканях. Помимо возможности трансфицировать клетки ДНК-плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, генную пушку можно адаптировать для доставки в клетки широкого спектра жизненно важных красителей. [16]

Бомбардировка генной пушкой также использовалась для трансформации Caenorhabditis elegans в качестве альтернативы микроинъекциям . [17]

Преимущества

Биолистика оказалась универсальным методом генетической модификации, и обычно ее предпочитают создавать устойчивые к трансформации культуры, такие как зерновые . Примечательно, что Bt- кукуруза является продуктом биолистики. [9] [ нужна страница ] Трансформация пластид также добилась больших успехов при бомбардировке частицами по сравнению с другими современными методами, такими как трансформация, опосредованная Agrobacterium , которая испытывает трудности с нацеливанием вектора на хлоропласт и его стабильной экспрессией в нем. [9] [ нужна страница ] [18] Кроме того, нет сообщений о том, что хлоропласт подавлял трансген, введенный с помощью генной пушки. [19] Кроме того, всего одним выстрелом из генной пушки опытный специалист может создать два трансформированных организма определенных видов. [18] Эта технология даже позволила модифицировать определенные ткани in situ , хотя это, вероятно, повредит большое количество клеток и трансформирует только некоторые , а не все клетки ткани. [20]

Ограничения

Биолистика случайным образом вводит ДНК в клетки-мишени. Таким образом, ДНК может быть трансформирована в любые геномы, присутствующие в клетке, будь то ядерные, митохондриальные, плазмидные или любые другие, в любой комбинации, хотя правильный дизайн конструкции может смягчить это. Доставка и интеграция нескольких матриц конструкции ДНК является вполне возможной, что приводит к потенциальным переменным уровням экспрессии и количеству копий вставленного гена. [9] [ нужна страница ] Это связано со способностью конструкций отдавать и забирать генетический материал из других конструкций, в результате чего некоторые не несут трансгена, а другие несут множественные копии; количество вставленных копий зависит как от того, сколько копий трансгена имеет вставленная конструкция, так и от того, сколько их было вставлено. [9] [ нужна страница ] Кроме того, поскольку эукариотические конструкции основаны на незаконной рекомбинации — процессе, посредством которого трансген интегрируется в геном без сходных генетических последовательностей — а не на гомологичной рекомбинации , они не могут быть нацелены на определенные места в геноме, [ 9] [ нужна страница ] за исключением случаев, когда трансген доставляется совместно с реагентами для редактирования генома .

Рекомендации

  1. ^ О'Брайен, Джон А.; Ламмис, Сара CR (2011). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми снарядами нанометрового размера». БМК Биотехнология . 11:66 . дои : 10.1186/1472-6750-11-66 . ПМК  3144454 . ПМИД  21663596.
  2. ^ Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер (6 марта 2015 г.). «Глава 11 - Стратегии доставки генов». Академическое издательство (Второе изд.). ISBN 978-0-12-800511-8.
  3. ^ Сэнфорд, Джон К. (1990). «Биолистическая трансформация растений». Физиология Плантарум . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x. ISSN  1399-3054.
  4. ↑ Сегелкен, Роджер (14 мая 1987 г.). «Биолог изобрел пистолет для стрельбы по клеткам ДНК» (PDF) . Корнеллские хроники . п. 3. Архивировано из оригинала (PDF) 29 октября 2013 года . Проверено 5 июня 2014 г.
  5. ^ Сэнфорд, Джей Си; Кляйн, ТМ; Вольф, Эд; Аллен, Н. (1987). «Доставка веществ в клетки и ткани с помощью процесса бомбардировки частиц». Наука и технология твердых частиц . 5 (1): 27–37. дои : 10.1080/02726358708904533.
  6. ^ Кляйн, ТМ; Вольф, Эд; Ву, Р.; Сэнфорд, Джей Си (май 1987 г.). «Высокоскоростные микроснаряды для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки». Природа . 327 (6117): 70–73. Бибкод : 1987Natur.327...70K. дои : 10.1038/327070a0. S2CID  4265777.
  7. ^ Сегелкен, Роджер. «Геновый дробовик». Колледж сельского хозяйства и наук о жизни Корнеллского университета. Архивировано из оригинала 26 апреля 2010 года . Проверено 5 июня 2014 г.
  8. ^ Рассел, Джули А.; Рой, Михир К.; Сэнфорд, Джон К. (1 марта 1992 г.). «Физическая травма и токсичность вольфрама снижают эффективность биолистической трансформации». Физиология растений . 98 (3): 1050–1056. дои : 10.1104/стр.98.3.1050. ISSN  0032-0889. ПМЦ 1080307 . ПМИД  16668726. 
  9. ^ abcdefgh Слейтер, Адриан; Скотт, Найджел; Фаулер, Марк (2008). Биотехнология растений: генетические манипуляции с растениями (2-е изд.). Оксфорд, Нью-Йорк, США: ISBN Oxford University Press Inc. 978-0-19-928261-6.
  10. ^ Бенфей, ПН; Чуа, Н.-Х. (16 ноября 1990 г.). «Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты: комбинаторная регуляция транскрипции в растениях». Наука . 250 (4983): 959–966. Бибкод : 1990Sci...250..959B. дои : 10.1126/science.250.4983.959. ISSN  0036-8075. PMID  17746920. S2CID  35471862.
  11. ^ «Терминатор нопалинсинтазы: темы Science.gov» . www.science.gov . Проверено 20 ноября 2019 г.
  12. ^ Норрис, Миннесота; Канг, Ю.; Лу, Д.; Уилкокс, бакалавр; Хоанг, Т.Т. (31 июля 2009 г.). «Резистентность к глифосату как новый, совместимый с селективными агентами, не селектируемый к антибиотикам маркер в хромосомном мутагенезе основных генов asd и dapB Burkholderia pseudomallei». Прикладная и экологическая микробиология . 75 (19): 6062–6075. Бибкод : 2009ApEnM..75.6062N. дои : 10.1128/aem.00820-09. ISSN  0099-2240. ПМК 2753064 . ПМИД  19648360. 
  13. ^ Блохлингер, К; Диггельманн, Х. (декабрь 1984 г.). «Гигромицин B-фосфотрансфераза как селектируемый маркер для экспериментов по переносу ДНК с высшими эукариотическими клетками». Молекулярная и клеточная биология . 4 (12): 2929–2931. дои : 10.1128/mcb.4.12.2929. ISSN  0270-7306. ПМК 369308 . ПМИД  6098829. 
  14. ^ Каррер, Хелейн; Хокенберри, Тиш Ноэль; Сваб, Зора; Малига, Пал (октябрь 1993 г.). «Устойчивость к канамицину как селектируемый маркер пластидной трансформации табака». MGG Молекулярная и общая генетика . 241–241 (1–2): 49–56. дои : 10.1007/bf00280200. ISSN  0026-8925. PMID  8232211. S2CID  2291268.
  15. ^ Гилбертсон, Ларри (декабрь 2003 г.). «Рекомбинация Cre-lox: творческие инструменты для биотехнологии растений». Тенденции в биотехнологии . 21 (12): 550–555. doi : 10.1016/j.tibtech.2003.09.011. ISSN  0167-7799. ПМИД  14624864.
  16. ^ Ган, Вэнь-Бяо; Грутцендлер, Хайме; Вонг, Вай Тонг; Вонг, Рэйчел О.Л .; Лихтман, Джефф В. (2000). «Многоцветная «диолистическая» маркировка нервной системы с использованием комбинаций липофильных красителей». Нейрон . 27 (2): 219–25. дои : 10.1016/S0896-6273(00)00031-3 . PMID  10985343. S2CID  16962732.
  17. ^ Прайтис, Вида (2006). «Создание трансгенных линий с использованием методов бомбардировки микрочастицами». К. Элеганс . Методы молекулярной биологии. Том. 351. С. 93–108. дои : 10.1385/1-59745-151-7:93. ISBN 978-1-59745-151-2. ПМИД  16988428.
  18. ↑ Аб Сэнфорд, Джон (28 апреля 2006 г.). «Биолистическая трансформация растений». Физиология Плантарум . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x.
  19. ^ Киккерт, Джули; Видаль, Хосе; Райш, Брюс (2005). «Стабильная трансформация растительных клеток путем бомбардировки частицами/биолистика». Трансгенные растения . Методы молекулярной биологии. Том. 286. стр. 61–78. дои : 10.1385/1-59259-827-7:061. ISBN 978-1-59259-827-4. PMID  15310913. S2CID  44395352.
  20. ^ Хейворд, доктор медицины; Боземарк, НЕТ; Ромагоса, Т. (2012). Селекция растений: основы и перспективы . Springer Science & Business Media. п. 131. ИСБН 9789401115247.

дальнейшее чтение

Внешние ссылки