stringtranslate.com

Генная пушка

Система доставки частиц PDS-1000/He

В генной инженерии генная пушка или система доставки биобаллистических частиц — это устройство, используемое для доставки экзогенной ДНК ( трансгенов ), РНК или белка в клетки. Покрывая частицы тяжелого металла интересующим геном и запуская эти микроснаряды в клетки с помощью механической силы, можно ввести интеграцию желаемой генетической информации в желаемые клетки. Метод, связанный с такой доставкой ДНК микроснарядами, часто называют биолистикой , сокращением от «биологическая баллистика». [1] [2]

Это устройство способно трансформировать практически любой тип клеток и не ограничивается трансформацией ядра; оно также может трансформировать органеллы, включая пластиды и митохондрии . [3]

Генная пушка используется для доставки экзогенной ДНК в клетки. Этот метод известен как «биолистика». Генные пушки могут эффективно использоваться на большинстве клеток, но в основном используются на растительных клетках.
  1. Генная пушка готова к стрельбе.
  2. Гелий заполняет камеру, и давление на разрывной диск возрастает.
  3. Давление в конечном итоге достигает точки, при которой разрывной диск ломается, и возникающий в результате выброс гелия выталкивает макроноситель с покрытием из ДНК/золота («пластиковый диск») в стопорный экран.
  4. Когда макроноситель попадает на стопорный экран, покрытые ДНК золотые частицы продвигаются через экран в целевые клетки.

Конструкция генной пушки

Генная пушка изначально была пневматическим пистолетом Crosman , модифицированным для стрельбы плотными вольфрамовыми частицами. Она была изобретена Джоном С. Сэнфордом , Эдом Вольфом и Нельсоном Алленом в Корнелльском университете [4] [5] [6] вместе с Тедом Кляйном из DuPont между 1983 и 1986 годами. Первоначальной целью был лук (выбранный из-за большого размера его клеток), и устройство использовалось для доставки частиц, покрытых геном-маркером , который передавал бы сигнал, если бы происходила правильная вставка транскрипта ДНК. [7] Генетическая трансформация была продемонстрирована при наблюдаемой экспрессии гена-маркера в клетках лука.

Самые ранние изготовленные на заказ генные пушки (изготовленные Нельсоном Алленом) использовали патрон для гвоздевого пистолета 22 калибра для запуска полиэтиленового цилиндра (пули) в ствол Дугласа 22 калибра. Капля вольфрамового порошка, покрытого генетическим материалом, помещалась на пулю и выстреливалась в чашку Петри ниже. Пуля приваривалась к диску под чашкой Петри, и генетический материал взрывался в образце с эффектом пончика, включающим опустошение в середине образца с кольцом хорошей трансформации по периферии. Пушка была подключена к вакуумному насосу и помещалась под вакуум во время стрельбы. Ранняя конструкция была запущена в ограниченное производство компанией Rumsey-Loomis (местная механическая мастерская, тогда находившаяся на Мекленбург-роуд в Итаке, штат Нью-Йорк, США).

Biolistics, Inc продала Dupont права на производство и распространение обновленного устройства с улучшениями, включая использование гелия в качестве невзрывчатого топлива и многодискового механизма доставки соударений для минимизации повреждения тканей образцов. Другие тяжелые металлы, такие как золото и серебро, также используются для доставки генетического материала, причем золото является предпочтительным из-за более низкой цитотоксичности по сравнению с вольфрамовыми носителями снарядов. [8]

Биолистическая конструкция

Биолистическая трансформация включает в себя интеграцию функционального фрагмента ДНК, известного как ДНК-конструкция, в целевые клетки. Генная конструкция представляет собой ДНК-кассету, содержащую все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в целевом организме. [9] [ нужна страница ] Хотя генные конструкции могут различаться по своей конструкции в зависимости от желаемого результата процедуры трансформации, все конструкции обычно содержат комбинацию промоторной последовательности, терминаторной последовательности, интересующего гена и репортерного гена .

Промоутер
Промоторы контролируют местоположение и величину экспрессии гена и выполняют функцию «руля и педали газа» гена. [9] [ нужна страница ] Промоторы предшествуют интересующему гену в конструкции ДНК и могут быть изменены посредством лабораторного проектирования для тонкой настройки экспрессии трансгена. Промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты является примером широко используемого промотора, который приводит к надежной конститутивной экспрессии гена в растениях. [10]
Терминатор
Последовательности терминатора необходимы для правильной экспрессии гена и размещаются после кодирующей области интересующего гена в конструкции ДНК. Обычным терминатором для биолистической трансформации является терминатор NOS, полученный из Agrobacterium tumefaciens . В связи с высокой частотой использования этого терминатора в генетически модифицированных растениях были разработаны стратегии для обнаружения его присутствия в пищевых продуктах для мониторинга несанкционированных ГМ-культур. [11] [ проверка не удалась ]
Ген-репортер
Ген, кодирующий селективный маркер, является общим элементом в конструкциях ДНК и используется для отбора правильно трансформированных клеток. Выбранный селективный маркер будет зависеть от трансформируемого вида, но обычно это будет ген, предоставляющий клеткам способность детоксикации определенных гербицидов или антибиотиков, таких как канамицин , гигромицин B или глифосат [9] [ нужна страница ] . [12] [13] [14]
Дополнительные элементы
Необязательные компоненты конструкции ДНК включают такие элементы, как последовательности cre-lox , которые позволяют контролируемое удаление конструкции из целевого генома. [15] Такие элементы выбираются разработчиком конструкции для выполнения специализированных функций наряду с основным интересующим геном.

Приложение

Генные пушки в основном используются с растительными клетками. Однако существует большой потенциал использования для людей и других животных.

Растения

Целью генной пушки часто является каллус недифференцированных растительных клеток или группа незрелых эмбрионов, растущих на гелевой среде в чашке Петри. После того, как покрытые ДНК золотые частицы доставлены в клетки, ДНК используется в качестве шаблона для транскрипции (транзиентная экспрессия), а иногда она интегрируется в хромосому растения ('стабильная' трансформация)

Если доставленная конструкция ДНК содержит селективный маркер, то стабильно трансформированные клетки могут быть отобраны и культивированы с использованием методов культивирования тканей. Например, если доставленная конструкция ДНК содержит ген, который придает устойчивость к антибиотику или гербициду, то стабильно трансформированные клетки могут быть отобраны путем включения этого антибиотика или гербицида в среду культивирования тканей.

Трансформированные клетки можно обрабатывать серией растительных гормонов, таких как ауксины и гиббереллины , и каждый из них может делиться и дифференцироваться в организованные, специализированные клетки тканей целого растения. Эта способность к полной регенерации называется тотипотентностью . Новое растение, которое произошло от успешно трансформированной клетки, может иметь новые наследуемые признаки. Использование генной пушки можно сравнить с использованием Agrobacterium tumefaciens и его плазмиды Ti для вставки ДНК в растительные клетки. См. трансформация для различных методов трансформации у разных видов.

Люди и другие животные

Генные пушки также использовались для доставки ДНК-вакцин .

Доставка плазмид в нейроны крыс с помощью генной пушки, в частности в нейроны DRG, также используется в качестве фармакологического прекурсора при изучении эффектов нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера .

Генная пушка стала обычным инструментом для маркировки подмножеств клеток в культивируемых тканях. Помимо возможности трансфицировать клетки ДНК-плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, генная пушка может быть адаптирована для доставки широкого спектра жизненно важных красителей в клетки. [16]

Бомбардировка генной пушкой также использовалась для трансформации Caenorhabditis elegans в качестве альтернативы микроинъекции . [17]

Преимущества

Биолистика оказалась универсальным методом генетической модификации, и ее обычно предпочитают для создания устойчивых к трансформации культур, таких как злаки . В частности, Bt- кукуруза является продуктом биолистики. [9] [ нужна страница ] Пластидная трансформация также имела большой успех с бомбардировкой частицами по сравнению с другими современными методами, такими как трансформация, опосредованная Agrobacterium , которые испытывают трудности с нацеливанием вектора на хлоропласт и его стабильной экспрессией в нем. [9] [ нужна страница ] [18] Кроме того, нет сообщений о том, что хлоропласт подавляет трансген, вставленный с помощью генной пушки. [19] Кроме того, с помощью всего лишь одного выстрела генной пушки опытный техник может создать два трансформированных организма у определенных видов. [18] Эта технология даже позволила модифицировать определенные ткани in situ , хотя это, вероятно, повредит большое количество клеток и трансформирует только некоторые , а не все, клетки ткани. [20]

Ограничения

Биолистика вводит ДНК случайным образом в целевые клетки. Таким образом, ДНК может быть преобразована в любые геномы, присутствующие в клетке, будь то ядерные, митохондриальные, плазмидные или любые другие, в любой комбинации, хотя правильный дизайн конструкции может смягчить это. Доставка и интеграция нескольких шаблонов конструкции ДНК является явной возможностью, что приводит к потенциально изменчивым уровням экспрессии и количеству копий вставленного гена. [9] [ нужна страница ] Это связано со способностью конструкций отдавать и принимать генетический материал от других конструкций, в результате чего некоторые не несут трансгена, а другие несут несколько копий; количество вставленных копий зависит как от того, сколько копий трансгена имеет вставленная конструкция, так и от того, сколько из них было вставлено. [9] [ нужна страница ] Кроме того, поскольку эукариотические конструкции основаны на незаконной рекомбинации — процессе, посредством которого трансген интегрируется в геном без схожих генетических последовательностей, — а не на гомологичной рекомбинации , их нельзя нацеливать на определенные места в геноме, [9] [ нужна страница ] если только трансген не доставляется совместно с реагентами для редактирования генома .

Ссылки

  1. ^ О'Брайен, Джон А.; Ламмис, Сара CR (2011). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми нанометровыми снарядами». BMC Biotechnology . 11 : 66. doi : 10.1186/1472-6750-11-66 . PMC  3144454. PMID  21663596 .
  2. ^ Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер (6 марта 2015 г.). «Глава 11 — Стратегии доставки генов». Academic Press (Второе издание). ISBN 978-0-12-800511-8.
  3. ^ Сэнфорд, Джон К. (1990). «Биологическая трансформация растений». Physiologia Plantarum . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x. ISSN  1399-3054.
  4. ^ Segelken, Roger (14 мая 1987 г.). «Биолог изобрел ружье для стрельбы по клеткам с ДНК» (PDF) . Cornell Chronicle . стр. 3. Архивировано из оригинала (PDF) 29 октября 2013 г. . Получено 5 июня 2014 г. .
  5. ^ Sanford, JC; Klein, TM; Wolf, ED; Allen, N. (1987). «Доставка веществ в клетки и ткани с использованием процесса бомбардировки частицами». Particulate Science and Technology . 5 (1): 27–37. doi :10.1080/02726358708904533.
  6. ^ Klein, TM; Wolf, ED; Wu, R.; Sanford, JC (май 1987). «Высокоскоростные микроснаряды для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки». Nature . 327 (6117): 70–73. Bibcode :1987Natur.327...70K. doi :10.1038/327070a0. S2CID  4265777.
  7. ^ Segelken, Roger. "The Gene Shotgun". Cornell University College of Agriculture and Life Sciences. Архивировано из оригинала 26 апреля 2010 года . Получено 5 июня 2014 года .
  8. ^ Рассел, Джули А.; Рой, Михир К.; Сэнфорд, Джон К. (1992-03-01). «Физическая травма и токсичность вольфрама снижают эффективность биолистической трансформации». Физиология растений . 98 (3): 1050–1056. doi :10.1104/pp.98.3.1050. ISSN  0032-0889. PMC 1080307. PMID 16668726  . 
  9. ^ abcdefgh Слейтер, Адриан; Скотт, Найджел; Фаулер, Марк (2008). Биотехнология растений: генетическая манипуляция растениями (2-е изд.). Оксфорд, Нью-Йорк, США: Oxford University Press Inc. ISBN 978-0-19-928261-6.
  10. ^ Бенфей, П. Н.; Чуа, Н.-Х. (1990-11-16). «Промотор вируса мозаики цветной капусты 35S: комбинаторная регуляция транскрипции у растений». Science . 250 (4983): 959–966. Bibcode :1990Sci...250..959B. doi :10.1126/science.250.4983.959. ISSN  0036-8075. PMID  17746920. S2CID  35471862.
  11. ^ "терминатор нопалинсинтазы: темы Science.gov". www.science.gov . Получено 2019-11-20 .
  12. ^ Норрис, МХ; Канг, И.; Лу, Д.; Уилкокс, БА; Хоанг, ТТ (31 июля 2009 г.). «Устойчивость к глифосату как новый селективный агент-совместимый, не-антибиотик-селективный маркер в хромосомном мутагенезе основных генов asd и dapB Burkholderia pseudomallei». Прикладная и экологическая микробиология . 75 (19): 6062–6075. Bibcode : 2009ApEnM..75.6062N. doi : 10.1128/aem.00820-09. ISSN  0099-2240. PMC 2753064. PMID 19648360  . 
  13. ^ Блохлингер, К; Диггельманн, Х (декабрь 1984 г.). «Фосфотрансфераза гигромицина В как селективный маркер для экспериментов по переносу ДНК с высшими эукариотическими клетками». Молекулярная и клеточная биология . 4 (12): 2929–2931. doi :10.1128/mcb.4.12.2929. ISSN  0270-7306. PMC 369308. PMID 6098829  . 
  14. ^ Каррер, Хелайн; Хокенберри, Тиш Ноэль; Сваб, Зора; Малига, Пал (октябрь 1993 г.). «Устойчивость к канамицину как селективный маркер для пластидной трансформации в табаке». MGG Molecular & General Genetics . 241–241 (1–2): 49–56. doi :10.1007/bf00280200. ISSN  0026-8925. PMID  8232211. S2CID  2291268.
  15. ^ Гилбертсон, Ларри (декабрь 2003 г.). «Рекомбинация Cre–lox: креативные инструменты для биотехнологии растений». Тенденции в биотехнологии . 21 (12): 550–555. doi :10.1016/j.tibtech.2003.09.011. ISSN  0167-7799. PMID  14624864.
  16. ^ Ган, Вэнь-Бяо; Грютцендлер, Хайме; Вонг, Вай Тонг; Вонг, Рэйчел ОЛ ; Лихтман, Джефф В (2000). «Многоцветная «диолистическая» маркировка нервной системы с использованием липофильных комбинаций красителей». Neuron . 27 (2): 219–25. doi : 10.1016/S0896-6273(00)00031-3 . PMID  10985343. S2CID  16962732.
  17. ^ Praitis, Vida (2006). «Создание трансгенных линий с использованием методов бомбардировки микрочастицами». C. Elegans . Методы в молекулярной биологии. Т. 351. С. 93–108. doi :10.1385/1-59745-151-7:93. ISBN 978-1-59745-151-2. PMID  16988428.
  18. ^ ab Sanford, John (28 апреля 2006 г.). «Биологическая трансформация растений». Physiologia Plantarum . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x.
  19. ^ Киккерт, Джули; Видал, Хосе; Райш, Брюс (2005). «Стабильная трансформация растительных клеток с помощью бомбардировки частицами/биолистической обработки». Трансгенные растения . Методы молекулярной биологии. Т. 286. С. 61–78. doi :10.1385/1-59259-827-7:061. ISBN 978-1-59259-827-4. PMID  15310913. S2CID  44395352.
  20. ^ Хейворд, Мэриленд; Босмарк, Норвегия; Ромагоза, Т. (2012). Селекция растений: принципы и перспективы . Springer Science & Business Media. стр. 131. ISBN 9789401115247.

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки