В химии биуретовый тест (IPA: / ˌ b aɪ j ə ˈ r ɛ t / , / ˈ b aɪ j ə ˌ r ɛ t / [1] ), также известный как тест Пиотровского , является химическим тестом , используемым для обнаружения наличия по крайней мере двух пептидных связей в молекуле. В присутствии пептидов ион меди (II) образует лиловые координационные комплексы в щелочном растворе. Реакция была впервые обнаружена в 1833 году; [2] В Польше биуретовый тест также известен как тест Пиотровского в честь польского физиолога Густава Пиотровского который независимо переоткрыл его в 1857 году. [ 3] Было разработано несколько вариантов теста, таких как тест BCA и модифицированный тест Лоури. [4]
Реакция биурета может быть использована для оценки концентрации белков, поскольку пептидные связи возникают с одинаковой частотой на аминокислоту в пептиде. Интенсивность окраски, а следовательно, и поглощение при 540 нм, прямо пропорциональны концентрации белка, согласно закону Бера-Ламберта .
Несмотря на свое название, реагент на самом деле не содержит биурет [(H 2 N−CO−) 2 NH] . Тест так назван, потому что он также дает положительную реакцию на пептидоподобные связи в молекуле биурета.
В этом анализе медь(II) связывается с атомами азота, присутствующими в пептидах белков. Во вторичной реакции медь(II) восстанавливается до меди(I). Буферы, такие как Трис и аммиак, мешают этому анализу, поэтому делая этот анализ непригодным для образцов белка, очищенных от осаждения сульфатом аммония. Из-за своей нечувствительности и небольшого вмешательства свободных аминокислот этот анализ наиболее полезен для образцов цельной ткани и других источников с высокой концентрацией белка. [5]
Водный образец обрабатывают равным объемом 1% сильного основания (гидроксида натрия или калия), а затем несколькими каплями водного сульфата меди (II) . Если раствор становится фиолетовым, он содержит белок. Можно определить 5–160 мг/ мл . Для значительного, измеримого изменения цвета с этими реагентами необходимы пептиды с правильной длиной не менее 3 аминокислот. [6]
Биуретовый реагент состоит из гидроксида натрия (NaOH) и гидратированного сульфата меди(II) вместе с тартратом калия-натрия , [7] последний из которых добавляется для хелатирования и, таким образом, стабилизации ионов меди. Реакция ионов меди с атомами азота, участвующими в пептидных связях, приводит к смещению атомов водорода пептида в щелочных условиях. Три- или тетрадентатное хелатирование с азотом пептида дает характерный цвет. Это обнаружено с дипептидами. [8]
Реагент обычно используется в биуретовом анализе белка — колориметрическом тесте, применяемом для определения концентрации белка с помощью УФ- и видимой спектроскопии при длине волны 540 нм.
В современном колориметрическом анализе пептидов обычно применяются две основные модификации биуретового теста: тест бицинхониновой кислоты (БКА) и тест Лоури. В этих тестах Cu + , образующийся в ходе биуретовой реакции, далее реагирует с другими реагентами, что приводит к более глубокому цвету.
В тесте BCA Cu + образует темно-фиолетовый комплекс с бицинхониновой кислотой (BCA), [9], которая поглощает около 562 нм, создавая характерный лиловый цвет. Водорастворимый комплекс BCA/медь поглощает гораздо сильнее, чем комплекс пептид/медь, увеличивая чувствительность биуретового теста примерно в 100 раз: анализ BCA позволяет обнаруживать белки в диапазоне от 0,0005 до 2 мг/мл. Кроме того, анализ белка BCA дает важное преимущество совместимости с такими веществами, как до 5% поверхностно-активных веществ в образцах белка.
В анализе белка Лоури Cu + окисляется обратно до Cu 2+ с помощью Mo VI в реагенте Фолина-Чокальтеу , который образует молибденовый синий (Mo IV ). Остатки тирозина в белке также образуют молибденовый синий при этих обстоятельствах. Таким образом, белки могут быть обнаружены в концентрациях от 0,005 до 2 мг/мл. [10] Молибденовый синий, в свою очередь, может связывать некоторые органические красители, такие как малахитовый зеленый и аурамин O , что приводит к дальнейшему усилению сигнала. [11]
