Белки наружной мембраны митохондрий идентифицируются с помощью маркировки близости.
Метка близости, катализируемая ферментом ( PL ), также известная как маркировка на основе близости , представляет собой лабораторную технику , которая маркирует биомолекулы , обычно белки или РНК , проксимальные к интересующему белку. [1] Создавая слияние генов в живой клетке между интересующим белком и сконструированным маркирующим ферментом, биомолекулы, пространственно близкие к интересующему белку, затем могут быть выборочно помечены биотином для извлечения и анализа. Маркировка близости использовалась для идентификации компонентов новых клеточных структур и для определения партнеров по взаимодействию белок-белок , среди других приложений. [2]
DamID — это метод, разработанный в 2000 году Стивеном Хеникоффом для идентификации частей генома, проксимальных к интересующему белку хроматина. DamID основан на слиянии ДНК-метилтрансферазы с белком хроматина для неестественного метилирования ДНК, которая затем может быть последовательно секвенирована для выявления участков метилирования генома вблизи белка. [4] Исследователи руководствовались стратегией белка слияния DamID для создания метода сайт-специфической маркировки белковых мишеней, что привело к созданию BioID на основе маркировки белка биотином в 2012 году. [1] Элис Тинг и лаборатория Тинг в Стэнфордском университете сконструировали несколько белков, которые демонстрируют улучшения в эффективности и скорости маркировки близости на основе биотина. [5] [6] [7] [8]
Принципы
Маркировка близости основана на маркирующем ферменте, который может биотинилировать близлежащие биомолекулы беспорядочно. Маркировка биотином может быть достигнута несколькими различными методами, в зависимости от вида маркирующего фермента.
BioID, также известная как BirA*, представляет собой мутантную биотинлигазу E. coli , которая катализирует активацию биотина АТФ. Активированный биотин является короткоживущим и, таким образом, может диффундировать только в область, близлежащую к BioID. Маркировка достигается, когда активированный биотин реагирует с близлежащими аминами , такими как амины боковой цепи лизина , обнаруженные в белках. [1] TurboID представляет собой биотинлигазу, разработанную с помощью направленной эволюции на основе дрожжевого поверхностного дисплея . TurboID обеспечивает время маркировки ~10 минут вместо ~18 часов, требуемых BioID. [5]
APEX — это производное аскорбатпероксидазы, зависящее от перекиси водорода для катализа окисления биотин-тирамида, также известного как биотин-фенол, до короткоживущего и реактивного свободного радикала биотин-фенола . Маркировка достигается, когда этот промежуточный продукт реагирует с различными функциональными группами близлежащих биомолекул. APEX также может использоваться для локального осаждения диаминобензидина, предшественника для окрашивания электронной микроскопией . APEX2 — это производное APEX, разработанное с помощью направленной эволюции дрожжевого поверхностного дисплея. APEX2 демонстрирует улучшенную эффективность маркировки и уровни клеточной экспрессии. [8]
Чтобы пометить белки рядом с интересующим белком, типичный эксперимент по маркировке близости начинается с клеточной экспрессии слияния APEX2 с интересующим белком, которое локализуется в нативной среде интересующего белка. Затем клетки инкубируют с биотин-фенолом, затем ненадолго с перекисью водорода, инициируя генерацию свободных радикалов биотин-фенола и маркировку. Чтобы минимизировать повреждение клеток, реакция затем гасится с помощью антиоксидантного буфера. Клетки лизируются, а меченые белки опускаются вниз с помощью стрептавидиновых шариков. Белки расщепляются трипсином , и, наконец, полученные пептидные фрагменты анализируются с помощью методов дробовика протеомики, таких как ЖХ-МС/МС или СФС-МС 3 . [8]
Если же слияние белков генетически недоступно (например, в образцах тканей человека), но известно антитело к интересующему белку, то маркировка по близости все равно может быть реализована путем слияния маркирующего фермента с антителом, а затем инкубации слияния с образцом. [9] [10]
Слияние APEX2 с рецепторами, сопряженными с G-белком (GPCR), позволяет отслеживать сигнализацию GPCR с 20-секундным временным разрешением [14] , а также идентифицировать неизвестные белки, связанные с GPCR. [15]
Маркировка близости также использовалась для транскриптомики и интерактомики . В 2019 году Элис Тинг и лаборатория Тинга использовали APEX для идентификации РНК, локализованной в определенных клеточных компартментах. [16] [17] В 2019 году BioID был привязан к транскрипту мРНК бета-актина для изучения динамики его локализации. [18] Маркировка близости также использовалась для поиска партнеров по взаимодействию гетеродимерных протеинфосфатаз , белка Ago2 miRISC (микроРНК-индуцированный комплекс подавления) и рибонуклеопротеинов . [3]
Последние события
Маркировка близости на основе TurboID использовалась для идентификации регуляторов рецептора, участвующего в врожденном иммунном ответе , NOD-подобного рецептора . [19] Маркировка близости на основе BioID использовалась для идентификации молекулярного состава инвадоподий клеток рака молочной железы , которые важны для метастазирования. [20] Исследования маркировки близости на основе биотина демонстрируют повышенное мечение белками внутренне неупорядоченных областей , что позволяет предположить, что маркировка близости на основе биотина может использоваться для изучения роли IDR. [21] Также была разработана малая молекула фотосенсибилизатора , нацеленная на ядро, для фотоактивируемой маркировки близости. [22]
Фотокаталитическая бесконтактная маркировка
Новый рубеж в области маркировки близости использует полезность фотокатализа для достижения высокого пространственного и временного разрешения проксимальных белковых микросред. [23] Эта фотокаталитическая технология использует фотонную энергию фотокатализаторов на основе иридия для активации диазириновых зондов, которые могут маркировать проксимальные белки в узком радиусе около четырех нанометров. [24] Эта технология была разработана Исследовательским научным центром Merck в сотрудничестве с исследователями из Принстонского университета . [24]
Ссылки
^ abc Roux, Kyle J.; Kim, Dae In; Raida, Manfred; Burke, Brian (2012-03-19). «Промискуитетный белок слияния биотинлигазы идентифицирует проксимальные и взаимодействующие белки в клетках млекопитающих». Journal of Cell Biology . 196 (6): 801–810. doi :10.1083/jcb.201112098. ISSN 0021-9525. PMC 3308701 . PMID 22412018.
^ ab Хан, Шуо; Ли, Цзефу; Тин, Элис Y (2018-06-01). «Маркировка близости: пространственно разрешенное протеомное картирование для нейробиологии». Current Opinion in Neurobiology . Neurotechnologies. 50 : 17–23. doi :10.1016/j.conb.2017.10.015. ISSN 0959-4388. PMC 6726430 . PMID 29125959.
^ ab Trinkle-Mulcahy, Laura (2019-01-31). "Последние достижения в методах маркировки на основе близости для картирования интерактомов". F1000Research . 8 : 135. doi : 10.12688/f1000research.16903.1 . ISSN 2046-1402. PMC 6357996 . PMID 30774936.
^ Стинсел, Бас ван; Хеникофф, Стивен (апрель 2000 г.). «Идентификация in vivo ДНК-мишеней хроматиновых белков с использованием привязанной метилтрансферазы Dam». Nature Biotechnology . 18 (4): 424–428. doi :10.1038/74487. ISSN 1546-1696. PMID 10748524. S2CID 30350384.
^ ab Branon, Tess C.; Bosch, Justin A.; Sanchez, Ariana D.; Udeshi, Namrata D.; Svinkina, Tanya; Carr, Steven A.; Feldman, Jessica L.; Perrimon, Norbert; Ting, Alice Y. (2018-10-01). "Эффективная маркировка близости в живых клетках и организмах с помощью TurboID". Nature Biotechnology . 36 (9): 880–887. doi :10.1038/nbt.4201. ISSN 1546-1696. PMC 6126969 . PMID 30125270.
^ ab Rhee, Hyun-Woo; Zou, Peng; Udeshi, Namrata D.; Martell, Jeffrey D.; Mootha, Vamsi K.; Carr, Steven A.; Ting, Alice Y. (2013-03-15). «Протеомное картирование митохондрий в живых клетках с помощью пространственно ограниченного ферментативного мечения». Science . 339 (6125): 1328–1331. Bibcode :2013Sci...339.1328R. doi :10.1126/science.1230593. ISSN 0036-8075. PMC 3916822 . PMID 23371551.
^ Lam, Stephanie S.; Martell, Jeffrey D.; Kamer, Kimberli J.; Deerinck, Thomas J.; Ellisman, Mark H.; Mootha, Vamsi K.; Ting, Alice Y. (январь 2015 г.). «Направленная эволюция APEX2 для электронной микроскопии и маркировки близости». Nature Methods . 12 (1): 51–54. doi :10.1038/nmeth.3179. hdl : 1721.1/110613 . ISSN 1548-7105. PMC 4296904 . PMID 25419960.
^ abc Kalocsay, Marian (2019). "APEX Peroxidase-Catalyzed Proximity Labeling and Multiplexed Quantitative Proteomics". В Sunbul, Murat; Jäschke, Andres (ред.). Proximity Labeling . Методы в молекулярной биологии. Т. 2008. Springer. С. 41–55. doi : 10.1007/978-1-4939-9537-0_4. ISBN978-1-4939-9537-0. PMID 31124087. S2CID 163166385. {{cite book}}: |work=проигнорировано ( помощь )
^ Риз, Джоанна С.; Ли, Сюэ-Вэнь; Перретт, Сара; Лилли, Кэтрин С.; Джексон, Энтони П. (2015-11-01). «Соседи белков и протеомика близости». Молекулярная и клеточная протеомика . 14 (11): 2848–2856. doi : 10.1074/mcp.R115.052902 . ISSN 1535-9476. PMC 4638030. PMID 26355100 .
^ Бар, Дэниел З.; Аткатш, Кэтлин; Таварес, Уррака; Эрдос, Майкл Р.; Грюнбаум, Йосеф; Коллинз, Фрэнсис С. (февраль 2018 г.). «Биотинилирование с помощью распознавания антител — метод маркировки близости». Nature Methods . 15 (2): 127–133. doi :10.1038/nmeth.4533. ISSN 1548-7091. PMC 5790613 . PMID 29256494.
^ Мик, Дэвид У.; Родригес, Рэйчел Б.; Лейб, Райан Д.; Адамс, Кристофер М.; Чиен, Эллис С.; Гиги, Стивен П.; Начури, Максенс В. (2015-11-23). «Протеомика первичных ресничек с помощью маркировки близости». Developmental Cell . 35 (4): 497–512. doi :10.1016/j.devcel.2015.10.015. ISSN 1878-1551. PMC 4662609 . PMID 26585297.
^ Youn, Ji-Young; Dunham, Wade H.; Hong, Seo Jung; Knight, James DR; Bashkurov, Michael; Chen, Ginny I.; Bagci, Halil; Rathod, Bhavisha; MacLeod, Graham; Eng, Simon WM; Angers, Stéphane (февраль 2018 г.). «Высокоплотное картирование близости выявляет субклеточную организацию гранул и телец, связанных с мРНК». Molecular Cell . 69 (3): 517–532.e11. doi : 10.1016/j.molcel.2017.12.020 . ISSN 1097-2765. PMID 29395067.
^ Берсукер, Кирилл; Петерсон, Кларк WH; То, Милтон; Саль, Штеффен Дж.; Савихин, Виктория; Гроссман, Элизабет А.; Номура, Дэниел К.; Ольцманн, Джеймс А. (2018-01-08). «Стратегия маркировки близости обеспечивает понимание состава и динамики протеомов липидных капель». Developmental Cell . 44 (1): 97–112.e7. doi : 10.1016/j.devcel.2017.11.020 . ISSN 1534-5807. PMC 5764092 . PMID 29275994.
^ Paek, Jaeho; Kalocsay, Marian; Staus, Dean P.; Wingler, Laura; Pascolutti, Roberta; Paulo, Joao A.; Gygi, Steven P.; Kruse, Andrew C. (6 апреля 2017 г.). «Многомерное отслеживание сигнализации GPCR с помощью катализируемой пероксидазой проксимальной маркировки». Cell . 169 (2): 338–349.e11. doi :10.1016/j.cell.2017.03.028. ISSN 1097-4172. PMC 5514552 . PMID 28388415.
^ Lobingier, Braden T.; Hüttenhain, Ruth; Eichel, Kelsie; Miller, Kenneth B.; Ting, Alice Y.; von Zastrow, Mark; Krogan, Nevan J. (6 апреля 2017 г.). «Подход к пространственно-временному разрешению сетей взаимодействия белков в живых клетках». Cell . 169 (2): 350–360.e12. doi :10.1016/j.cell.2017.03.022. ISSN 1097-4172. PMC 5616215 . PMID 28388416.
^ Шилдс, Эмили Дж.; Петраковичи, Ана Ф.; Бонасио, Роберто (15.04.2019). «Невероятно универсальные: биохимические и биологические функции длинных некодирующих РНК». Biochemical Journal . 476 (7): 1083–1104. doi : 10.1042/BCJ20180440. ISSN 0264-6021. PMC 6745715. PMID 30971458 .
^ Фазал, Фуркан М.; Хан, Шуо; Паркер, Кевин Р.; Каевсапсак, Порнчай; Сюй, Цзинь; Беттигер, Алистер Н.; Чанг, Ховард Ю.; Тинг, Алиса Ю. (11 июля 2019 г.). «Атлас субклеточной локализации РНК, выявленный с помощью APEX-Seq». Клетка . 178 (2): 473–490.e26. дои : 10.1016/j.cell.2019.05.027 . ISSN 0092-8674. ПМК 6786773 . ПМИД 31230715.
^ Мукерджи, Джойита; Хермеш, Орит; Елискович, Каролина; Нальпас, Николас; Франц-Вахтель, Мирита; Мачек, Борис; Янсен, Ральф-Петер (25 июня 2019 г.). «Картирование интерактома мРНК β-актина путем биотинилирования по близости». Труды Национальной академии наук . 116 (26): 12863–12872. Бибкод : 2019PNAS..11612863M. дои : 10.1073/pnas.1820737116 . ISSN 0027-8424. ПМК 6600913 . ПМИД 31189591.
^ Чжан, Юнлян; Сун, Гаоюань; Лал, Нирадж К.; Нагалакшми, Уграппа; Ли, Юаньюань; Чжэн, Вэньцзе; Хуан, Пинь-цзюй; Бранон, Тесс К.; Тинг, Элис Ю.; Уолли, Джастин В.; Динеш-Кумар, Савитрамма П. (19 июля 2019 г.). «Близкая маркировка на основе TurboID показывает, что UBR7 является регулятором иммунитета, опосредованного иммунными рецепторами N NLR». Природные коммуникации . 10 (1): 3252. Бибкод : 2019NatCo..10.3252Z. дои : 10.1038/s41467-019-11202-z . ISSN 2041-1723. ПМК 6642208 . PMID 31324801.
^ Туо, Сильви; Мамелоне, Клэр; Саламе, Жоэль; Остаколо, Кевин; Чанес, Брис; Салаун, Даниэль; Боделе, Эмили; Одебер, Стефан; Камуан, Люк; Бадаче, Али (22 апреля 2020 г.). «Протеомный подход с маркировкой близости к исследованию молекулярного ландшафта инвадоподий в клетках рака молочной железы». Научные отчеты . 10 (1): 6787. Бибкод : 2020NatSR..10.6787T. дои : 10.1038/s41598-020-63926-4 . ISSN 2045-2322. ПМЦ 7176661 . ПМИД 32321993.
^ Минде, Дэвид-Пол; Рамакришна, Манаса; Лилли, Кэтрин С. (2020-01-22). «Биотиновое приближение меток благоприятствует развёрнутым белкам и позволяет изучать внутренне неупорядоченные области». Communications Biology . 3 (1): 38. doi : 10.1038/s42003-020-0758-y . ISSN 2399-3642. PMC 6976632 . PMID 31969649.
