Большой опухолевый антиген (также называемый большим Т-антигеном и сокращенно LTag или LT ) — это белок, кодируемый в геномах полиомавирусов , которые представляют собой небольшие двухцепочечные ДНК-вирусы . LTag экспрессируется на ранней стадии инфекционного цикла и необходим для вирусной пролиферации. Содержащий четыре хорошо сохранившихся белковых домена , а также несколько внутренне неупорядоченных областей , LTag является довольно большим многофункциональным белком; у большинства полиомавирусов его длина составляет около 600-800 аминокислот . LTag имеет две основные функции, обе из которых связаны с репликацией вирусного генома : он раскручивает ДНК вируса, чтобы подготовить ее к репликации, и взаимодействует с белками в клетке-хозяине, чтобы нарушить регуляцию клеточного цикла , так что аппарат репликации ДНК хозяина может быть использован для репликации генома вируса. Некоторые белки полиомавируса LTag, в частности, хорошо изученный большой опухолевый антиген SV40 вируса SV40 , являются онкобелками , которые могут вызывать неопластическую трансформацию в клетке-хозяине. [2] [3]
Белки LTag полиомавируса содержат четыре хорошо сохранившихся глобулярных белковых домена : от N- до C-конца это домен J, домен связывания источника (OBD), домен связывания цинка и домен AAA+ АТФазы . Домены связаны внутренне неупорядоченными областями , которые сами по себе часто функционально важны и длина которых варьируется среди полиомавирусов; как сложенные глобулярные домены, так и неупорядоченные области образуют белок-белковые взаимодействия с рядом белков клетки-хозяина. Некоторые гомологи LTag также имеют неупорядоченный C-концевой хвост, называемый доменом диапазона хозяина, который может фосфорилироваться и в некоторых штаммах является необходимым, хотя молекулярный механизм его существенности неясен. [3]
В некоторых полиомавирусах укороченные варианты белка LTag производятся посредством альтернативного сплайсинга , который не включает компоненты геликазы (связывание цинка и АТФазы). Эти укороченные LTag сохраняют способность взаимодействовать с некоторыми регуляторными белками клеточного цикла и участвуют в трансформации клеток, но не в репликации вирусного генома. [2] [4]
Домен J представляет собой молекулярный шаперон DnaJ , который необходим для репликации вирусного генома in vivo (но не является обязательным в бесклеточных лабораторных экспериментах). Домен J взаимодействует с белками теплового шока Hsc70 . Во многих полиомавирусных LTag N-конец домена J представляет собой мотив последовательности , который опосредует связывание LTag с белком ретинобластомы клетки-хозяина , ключевым фактором, определяющим прогрессирование клеточного цикла . Эта неструктурированная линкерная область также содержит последовательность ядерной локализации , которая запускает клетку-хозяина для транспортировки белка из цитоплазмы , где он транслируется, в ядро , где он выполняет свои функции, связанные с репликацией. [3]
OBD связывает начало репликации вирусного генома , распознавая определенные последовательности, которые встречаются в части вирусного генома, известной как некодирующая контрольная область . Он также формирует взаимодействия с белками клетки-хозяина, такими как репликационный белок A и Nbs1 . OBD необходим для репликации вируса. [3]
Цинк-связывающий и АТФазный домены вместе составляют геликазную часть белка LTag. Основной функцией цинк -связывающего домена является олигомеризация LTag. Формирование додекамерных структур (два гексамерных кольца) необходимо для геликазной активности, которая начинается в начале репликации посредством координации между OBD, цинк-связывающим и АТФазным доменами. [2] [3]
Домен АТФазы является членом семейства АТФаз AAA+ и содержит консервативные мотивы, такие как связывающий АТФ блок Walker A. Энергия от гидролиза АТФ необходима для активности геликазы . Домен АТФазы также содержит области, отвечающие за белок-белковые взаимодействия с белками клетки-хозяина, в первую очередь топоизомеразой 1 и регулятором клеточного цикла p53 . LTag уникален среди известных АТФаз AAA+ тем, что он способен инициировать плавление ДНК вокруг начала; в большинстве таких случаев за этот шаг отвечает отдельный белок-инициатор, после чего геликаза продолжает раскручиваться. [2] [3]
Основные функции LTag в жизненном цикле вируса включают нарушение регуляции клеточного цикла клетки-хозяина и репликацию кольцевого генома ДНК вируса. Поскольку репликация генома полиомавируса зависит от аппарата репликации ДНК клетки-хозяина, клетка должна находиться в S-фазе (часть клеточного цикла, в которой геном клетки-хозяина обычно реплицируется), чтобы обеспечить необходимый молекулярный аппарат для репликации вирусной ДНК. LTag SV40 может индуцировать S-фазу и активировать реакцию повреждения ДНК клетки-хозяина. [3] Координированные действия областей OBD и геликазы приводят к физическому манипулированию вирусным геномом, расплавляя двойную спираль ДНК в начале репликации и раскручивая кольцевую хромосому ДНК двунаправленным образом. [2] [3] Структура и функция LTag напоминают таковые у онкопротеинов вируса папилломы человека . [2]
LTag кодируется в «ранней области» генома полиомавируса, названной так потому, что эта область генома экспрессируется на ранней стадии инфекционного процесса. («Поздняя область» содержит гены, кодирующие вирусные капсидные белки .) Ранняя область обычно содержит по крайней мере два гена и транскрибируется как одна информационная РНК, обработанная альтернативным сплайсингом . Ген LTag обычно кодируется в двух экзонах , из которых первый перекрывается с геном малого опухолевого антигена (STag); в результате два белка имеют общую N-концевую последовательность из примерно 80 остатков, в то время как остальные ~90 остатков STag не являются общими. [4] [7] У нескольких полиомавирусов — в частности, у мышиного полиомавируса , первого обнаруженного члена семейства и эффективного онковируса — дополнительный белок, называемый средним опухолевым антигеном, экспрессируется из ранней области и очень эффективен при клеточной трансформации. [8]
Некоторые, но не все, полиомавирусы являются онковирусами , способными вызывать неопластическую трансформацию в некоторых клетках. В онкогенных полиомавирусах опухолевые антигены отвечают за активность трансформации, хотя точные молекулярные механизмы различаются от одного вируса к другому. [3] [2] [9]
Большой антиген T вируса SV40 является наиболее хорошо изученным членом семейства LTag. SV40, также известный как полиомавирус Macaca mulatta 1, изначально заражает обезьян и не вызывает заболевания; однако он является онкогенным у некоторых грызунов и может увековечивать некоторые клетки человека в первичной клеточной культуре . SV40 имеет три ранних белка : большой опухолевый антиген, малый опухолевый антиген и небольшой белок, называемый 17kT, который разделяет большую часть своей последовательности с N-концом LTag. Из них LTag в первую очередь отвечает за клеточную трансформацию. STag сам по себе не может трансформировать клетки, но повышает эффективность, с которой LTag выполняет эту функцию. Трансформирующий эффект LTag в значительной степени можно объяснить его способностью связывать белок ретинобластомы (Rb) и белок- супрессор опухоли p53 ; отмена любого из сайтов связывания делает LTag неспособным трансформировать первичные культивируемые клетки. [10] Фактически, p53, который теперь признан ключевым фактором канцерогенеза, был первоначально обнаружен благодаря его способности связывать LTag. [10] [11] [12]
Полиомавирус мышей (MPyV), описанный в 1950-х годах, был первым обнаруженным полиомавирусом и может вызывать опухоли у грызунов. MPyV имеет три ранних белка; в дополнение к LTag и STag он также экспрессирует средний опухолевый антиген , который в первую очередь отвечает за трансформирующую активность вируса. [10]
Полиомавирус клеток Меркеля (MCPyV), также известный как человеческий полиомавирус 5 , естественным образом заражает людей и связан с карциномой клеток Меркеля (MCC), редкой формой рака кожи , происходящей из клеток Меркеля . Хотя инфекция MCPyV распространена и обычно протекает бессимптомно, подавляющее большинство опухолей MCC обладают геномно интегрированной копией генома полиомавируса. [9] [13] MCPyV обладает четырьмя ранними белками, включая альтернативную изоформу сплайсинга 57kT и альтернативный белок, называемый ALTO. У полиомавируса клеток Меркеля, в отличие от SV40, один LTag не поддерживает эффективную репликацию вируса, и требуется STag. Сравнение последовательностей MCPyV и LTag SV40 предсказывает, что они обладают схожими возможностями для белок-белковых взаимодействий , включая сохранение сайтов связывания Rb и p53. [9] Мутации в MCPyV LTag, связанные с опухолями, состоят из крупных усечений C-конца, которые устраняют функции репликации ДНК белка путем удаления доменов связывания цинка и АТФазы/хеликазы, не затрагивая эти сайты взаимодействия белок-белок. [14] [15]
LTag — это большой белок, домены которого можно обнаружить и аннотировать биоинформатически . В результате он часто используется для сравнения и определения взаимосвязей между полиомавирусами. Международный комитет по таксономии вирусов в настоящее время классифицирует полиомавирусы в первую очередь в соответствии с идентичностью последовательностей их генов LTag. [16] Эта система была подвергнута сомнению филогенетическими исследованиями, предполагающими, что эволюционные истории LTag и основного капсидного белка VP1 расходятся и что некоторые современные полиомавирусы представляют собой химерные линии. [17]