Ботромицин — макроциклический пептид с антибиотической активностью. Впервые он был обнаружен в 1957 году как натуральный продукт, выделенный из Streptomyces bottropensis . [1] Было показано, что он ингибирует метициллин-резистентный Staphylococcus aureus ( MRSA ) и ванкомицин-резистентные Enterococci ( VRE ) среди других грамположительных бактерий и микоплазм . [2] Ботромицин структурно отличается как от ванкомицина , гликопептидного антибиотика , так и от метициллина , бета-лактамного антибиотика .
Ботромицин связывается с сайтом А рибосомы и блокирует связывание аминоацил -т РНК , тем самым подавляя синтез бактериального белка. [3] Хотя боттромицин проявляет антибактериальную активность in vitro , он еще не был разработан как клинический антибиотик, возможно, из-за его плохой стабильности в плазме крови. [2] Для повышения его стабильности in vivo были исследованы некоторые производные боттромицина. [2]
Структура боттромицина содержит макроциклический амидин , а также тиазольное кольцо. Абсолютная стереохимия в нескольких хиральных центрах была определена по состоянию на 2009 год. [4] В 2012 году была опубликована трехмерная структура раствора боттромицина. [5] Структура раствора показала, что несколько метильных групп находятся на одной и той же стороне структуры.
Ботромицин относится к классу пептидов природного происхождения, синтезируемых рибосомами и модифицируемых посттрансляционно . [6]
Ботромицин был впервые выделен из Streptomyces bottropensis в 1957 году. [1] С тех пор он был идентифицирован по крайней мере у двух других представителей рода Streptomyces ; [6] [7] Известно, что представители Streptomyces являются плодовитыми производителями вторичных метаболитов. [8] Ботромицин имеет уникальную структуру, состоящую из макроциклической амидиновой связи и четырех β-метилированных аминокислот. Ботромицин блокирует связывание аминоацил- т -РНК с рибосомой, связываясь с сайтом A субъединицы 50s. [3] Хотя ботромицин был открыт более 50 лет назад, до недавнего времени после первоначальных исследований боттромицина не проводилось никаких исследований. Отсутствие исследований потенциально является результатом низкой стабильности боттромицина в плазме крови. [2] Однако уникальная структура и способ действия в последнее время сделали боттромицин более привлекательной целью для разработки лекарственных средств, особенно с учетом роста устойчивости к антибиотикам. [ необходима ссылка ]
Механизм действия боттромицина был подтвержден почти через 20 лет после открытия боттромицина. [3] Ботромицин действует как антибиотик посредством ингибирования синтеза белка. Он блокирует связывание аминоацил -т -РНК с рибосомой, связываясь с сайтом А субъединицы 50s. Это приводит к высвобождению аминоацил- т -РНК из рибосомы и преждевременному прекращению синтеза белка. Сравнение других антибиотиков, которые, как известно, связываются с сайтом А рибосомы, включая микрококцин, тетрациклин , стрептомицин и хлорамфеникол , показало, что только боттромицин и хлорамфеникол вызывают высвобождение аминоацил- т -РНК из рибосомы. Из этих антибиотиков только микрококцин также является макроциклическим пептидом. [ необходима цитата ]
Ботромицин вырабатывается естественным образом в виде серии продуктов, различающихся по схемам метилирования. Все продукты содержат метилирование валина и фенилаланина. Ботромицин А2 однократно метилирован по пролину, у ботромицина В отсутствует метилирование по пролину, а ботромицин С содержит дважды метилированный пролин. [ необходима цитата ]
Частичная структура боттромицина была сообщена вскоре после первоначального открытия боттромицина. Первые структурные исследования основывались на традиционных методах анализа. Его пептидоподобная структура, включая присутствие глицина и валина, была впервые предложена комбинацией кислотного гидролиза , ацетилирования , окрашивания нингидрином и бумажной хроматографии , среди прочих экспериментов. [9] Наличие тиазольного кольца вместе с соседним β-метилированным фенилаланином было установлено окрашиванием нингидрином, окислением перманганатом калия и сравнением с синтетическими стандартами. [10] Заместитель метилового эфира был сообщен в 1958 году. [11] В том же исследовании также сообщалось, что продукт гидролиза Кунца, лишенный метилового эфира, был биологически неактивен. Накамура и коллеги позже сообщили, что боттромицин содержал трет-лейцин и цис -3-метилпролин. [12] Они также предложили линейную иминогексапептидную структуру. [13]
Эти ранние структурные исследования не были продолжены до недавних лет с возобновлением интереса к боттромицину. Структура была подтверждена в 1980-х и 1990-х годах как циклический иминопептид на основе исследований ЯМР с линейной боковой цепью, связанной с макроциклом через амидиновую связь. [14] [15]
Однако его абсолютная стереохимия не была охарактеризована до 2009 года. [4] Стереохимия на углероде 18 и 25 была предложена путем сравнения предсказанных конформеров, полученных с помощью молекулярной динамики , с экспериментальными ограничениями, полученными с помощью экспериментов ЯМР. Стереохимия на углероде 43 была подтверждена путем сравнения 1 H ЯМР аутентичного продукта гидролиза с химически синтезированным образцом того же фрагмента. Наконец, эксперименты по оптическому вращению, 1 H ЯМР и HRMS химически синтезированного боттромицина совпали с экспериментами биологически произведенного боттромицина. [ необходима цитата ]
Трехмерная структура раствора боттромицина А2 была решена методом ЯМР в 2012 году. [5] Общая структура была получена с хорошим разрешением (RMSD 0,74±0,59 Å) с RMSD 0,09±0,06 Å для макроцикла. В этом исследовании было высказано предположение, что метилированный остаток пролина способствовал ограниченной конформации макроцикла. Было обнаружено, что метилированный остаток пролина и остатки β-OMe аланина находятся на одной и той же стороне боттромицина А2, и было высказано предположение, что эта характеристика способствовала связыванию боттромицина с сайтом рибосомы А.
Было изучено производство боттромицина S. bottropensis и S. scabies , а также производство аналога боттромицина, названного боттромицином D. [6] [7] [16] [17] В 2012 году несколько групп независимо подтвердили, что боттромицин производится как рибосомальный пептидный натуральный продукт, который впоследствии был посттрансляционно модифицирован. До этого было неясно, был ли боттромицин произведен нерибосомальным пептидсинтетазным аппаратом (NRPS). Наличие аминокислот, отличных от 20 протеиногенных аминокислот, часто является особенностью продуктов NRPS, поскольку аппарат NRPS может напрямую включать другие аминокислоты, среди других химических строительных блоков. Рибосомальный пептидный синтез, который является тем же аппаратом, который производит все белки, обнаруженные в клетке, ограничен 20 протеиногенными аминокислотами. Однако было обнаружено, что боттромицин представляет собой сильно модифицированный рибосомальный пептид с помощью комбинации исследований геномного анализа и удаления генов. [7] [16]
В рибосомальном пептидном синтезе конечный продукт получается в результате модификаций линейного пептидного исходного материала, транслируемого рибосомой из транскрипта мРНК. У S. scabies пептид-предшественник, называемый BtmD, представляет собой пептид из 44 аминокислот. [7] У S. bottropensis пептид-предшественник называется BmbC . [16] Аминокислоты, образующие ядро боттромицина, представляют собой остатки 2-9 в BtmD: Gly-Pro-Val-Val-Val-Phe-Asp-Cys. У боттромицина D последовательность представляет собой Gly-Pro-Ala-Val-Val-Phe-Asp-Cys, а пептид-предшественник называется BstA. [17] BstA имеет высокую гомологию последовательностей с BtmD в области последующего пептида. В отличие от других рибосомальных пептидных природных продуктов, которые обычно синтезируются с лидерным пептидом, который расщепляется, боттромицин синтезируется с последующим пептидом. Наличие последующего пептида было выявлено с помощью биоинформатического анализа биосинтетического кластера боттромицина.
Был идентифицирован полный кластер генов биосинтеза боттромицина. Предполагается, что он содержит 13 генов, включая пептид-предшественник (обозначения будут следовать Крону и коллегам; [7] другие исследования имели схожие результаты). Один из генов в кластере, btmL , предположительно является регулятором транскрипции . Другой ген, btmA , предположительно экспортирует боттромицин. Ожидается, что оставшиеся десять генов модифицируют пептид-предшественник btmD из линейного пептида в конечный макроциклический продукт.
Биосинтетический путь был выдвинут на основе предполагаемых функций гена (см. рисунок). btmM , гомологичный Zn+2 аминопептидазам, как предполагается, расщепляет N-концевой остаток метионина, который отсутствует в конечном продукте боттромицина. btmE и btmF оба содержат YcaO -подобные домены. Считается, что один Хотя неясно, какой фермент отвечает за какой этап, предполагается, что один катализирует образование макроциклического амидина, а другой катализирует образование тиазолина. btmJ , кодирующий фермент с гомологией цитохрома P450, может окислять тиазолин до тиазола. btmH или btmI оба гомологичны гидролитическим ферментам (α/β-гидролазе и металлозависимой гидролазе соответственно) и могут катализировать гидролиз последующего пептида. Альтернативная предложенная роль btmH или btmI заключается в том, чтобы функционировать как циклодегидратаза в макроциклизации. Исследования делеции генов не смогли выяснить функцию других белков в кластере. [7]
Биоинформатический анализ выявил четыре метилтрансферазы в кластере. Биоинформатика предполагает, что btmB является O -метилтрансферазой , в то время как другие три, btmC , G и K , являются радикальными S -аденозилметионин (SAM) метилтрансферазами . Считается, что радикальные SAM метилтрансферазы β-метилируют аминокислотные остатки в пептиде-предшественнике. Считается, что btmC метилирует фенилаланин, btmG метилирует оба валина, а btmK метилирует пролин на основе исследований делеции генов. [6] [7]
Три предполагаемые радикальные метилтрансферазы SAM, закодированные в этом пути, интересны как по механистическим, так и по биосинтетическим причинам. Радикальные метилтрансферазы SAM, вероятно, метилируют субстраты по необычному механизму. С точки зрения биосинтеза, β-метилирование аминокислот весьма необычно для природных продуктов. Политеонамид B, пептидный природный продукт, производимый морским симбионтом, является единственным другим структурно охарактеризованным примером прямого β-метилирования пептидного природного продукта. Предложенный перенос метильной группы от фермента, использующего SAM, был поддержан более ранними исследованиями кормления меченым метионином; меченый метионин используется, поскольку метионин превращается в SAM внутри клеток. [18] Более того, в этом исследовании использовался стереоспецифически меченый метионин ([метил-( 2H - 3H )]-(2S , метил- R )-метионин), чтобы показать, что метилирование происходило с чистым сохранением стереохимии в метильной группе. Автор предположил, что чистое удержание указывает на радикальный механизм с промежуточным звеном B12. [18] Радикальный перенос с кофактором кобаламина B12 и SAM был показан с несколькими охарактеризованными радикальными метилтрансферазами SAM. Хотя доказательства указывают на радикальное β-метилирование во время биосинтеза боттромицина, еще предстоит выяснить, будут ли биоинформатическая гипотеза и исследования кормления поддержаны анализами активности in vitro .
Замена Val3Ala в боттромицине D не изменяет паттерн β-метилирования между боттромицином A2 и D, поскольку Val3 является единственным валином, не метилированным в боттромицине A2. Таким образом, в биосинтетическом кластере боттромицина D все еще есть три предсказанных радикальных SAM-зависимых фермента: bstC , bstF и bstJ . [17]
По состоянию на 2013 год все опубликованные биосинтетические исследования были биоинформатическими или основанными на клетках. Пока не опубликовано ни одного биохимического анализа, напрямую демонстрирующего функцию белка. Вероятно, что в будущем появятся механистические исследования in vitro для лучшего выяснения биосинтетического пути.
Полный синтез боттромицина был завершен в 2009 году. [4] Синтез был завершен в 17 этапов. Хотя боттромицин является натуральным продуктом на основе пептидов, он содержит необычный макроцикл и тиазольный гетероцикл, поэтому полный синтез не мог быть завершен с использованием традиционного твердофазного пептидного синтеза . Синтез был завершен с использованием комбинации пептидного связывания и других методов. Для получения первичного промежуточного соединения тиа-β-Ala-OMe была проведена последовательность этапов конденсации, реакции Манниха и катализируемого палладием декарбоксилирования. Это промежуточное соединение было получено стереоселективно. Для получения амидиновой связи трипептидное промежуточное соединение было соединено с защищенным фталоилом тиоамидом посредством конденсации, опосредованной ртутью, с использованием трифторметансульфоната ртути (II) ( Hg(OTf) 2 ), чтобы получить разветвленное промежуточное соединение амидина. Для получения конечного макроцикла продукта требовалась макролактамизация промежуточного соединения, содержащего амидин. Макролактамизация была проведена с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDCI) и iPr 2 NEt , что дало конечный продукт, боттромицин A2. Чтобы подтвердить, что синтезированный боттромицин A2 имел ту же стереохимию, что и природный боттромицин A2, продукт был изучен с помощью оптического вращения , 1 H и 13 C ЯМР, ИК и HRMS. Было обнаружено, что данные соответствуют данным для изолированного боттромицина A2. Кроме того, было также обнаружено, что синтетический образец боттромицина обладает антибактериальной активностью против как MRSA, так и VRE, хотя количественные данные не были представлены. Полную визуализацию синтетической схемы можно увидеть по ссылке на свернутые синтетические схемы.
В 2012 году был опубликован альтернативный синтез макроциклической кольцевой системы боттромицина и амидиновой связи. [19] Синтез был выполнен в 10 этапов. В отличие от предыдущего синтеза, Акерман и его коллеги синтезировали линейный пептид и добились внутримолекулярного образования амидина с использованием S -метилированного эндотиопептида. Эндотиопептид был получен с помощью реакции тио-Уги . Полученный макроцикл был получен в виде рацемической смеси по амидиновой связи. Полную схему синтеза можно просмотреть по ссылке на свернутые схемы синтеза.
После полного синтеза боттромицина Кобаяши и коллеги синтезировали ряд производных боттромицина и оценили их активность против MRSA и против VRE. [2] Были исследованы только производные фрагмента метилового эфира, поскольку они обнаружили, что метиловый эфир важен для антибактериальной активности и нестабилен в плазме крови. Была синтезирована серия из семнадцати производных, причем производные делятся на три общие категории: производные амида , производные мочевины и производные кетонов . Все аналоги, за исключением аналогов карбоновой кислоты и гидразида, были дериватизированы из изолированного боттромицина А2 с использованием активированного азидного эфира. Производные были протестированы против шести штаммов грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus FDA209P, S. aureus Smith, MRSA HH-1, MRSA 92-1191, Enterococcus faecalis NCTC12201 и E. faecalis NCTC12203 (оба VRE).
Ботромицин А2 имел низкую микромолярную активность против всех протестированных штаммов, в диапазоне от МИК 0,5 мкг/мл в E. faecalis NCTC12203 до 2 мкг/мл в MRSA HH-1. Было обнаружено, что семейства производных амида и мочевины имеют более слабую антибактериальную активность, чем боттромицин А2 против S. aureus , MRSA и VRE. Значения МИК для производных амида и мочевины, как правило, были в четыре раза выше, чем для боттромицина А2. Однако они были значительно более стабильны в плазме мышей, чем боттромицин А2. Ботромицин А2 полностью разложился в плазме мышей через 10 минут и показал 0% остаточной активности после воздействия сыворотки крысы. Только одно производное имело остаточную активность ниже 50%. Напротив, многие производные сохранили значительный процент остаточной активности против MRSA после воздействия сыворотки. Было обнаружено, что тиоэфирные промежуточные соединения с производными кетонов нестабильны, проявляя 0% остаточной активности, хотя они имели улучшенную антибактериальную активность, демонстрируя субмикромолярные значения МИК. Было обнаружено, что пропилкетон является наиболее многообещающим производным из всех полученных аналогов, оба проявляя антибактериальную активность против протестированных бактериальных штаммов и стабильность в плазме, сохраняя 100% остаточную активность. Значения МИК, полученные для производного пропила, были такими же, как и для боттромицина А2, за исключением случая NCTC12201, который имел МИК 2 мкг/мл для производного и МИК 1 мкг/мл для боттромицина А2. Сводка значений МИК для протестированных бактериальных штаммов представлена ниже.
Даже наименее активные производные боттромицина проявили большую активность против VRE, чем ванкомицин, который использовался в качестве контрольного антибиотика в этом исследовании. Производное пропила и боттромицин А2 имели аналогичную антимикробную активность линезолида , синтетического антибиотика, активного против грамположительных бактерий, включая MRSA и VRE, во всех исследованных штаммах бактерий. В целом, результаты этого исследования показали, что дальнейшие модификации боттромицина могут привести к более стабильному, эффективному антибиотику.
Также было идентифицировано природное производное боттромицина, боттромицин D. [17] Он вырабатывается в морском виде Streptomyces , штамм WMMB272. Хотя метиловый эфир все еще присутствует в боттромицине D, один из макроциклических валинов мутировал в аланин. Была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для боттромицина D, и было обнаружено, что он лишь немного менее активен, чем боттромицин A2 (2 мкг/мл для боттромицина D против 1 мкг/мл для боттромицина A2). Авторы предположили, что большая конформационная гибкость боттромицина D может быть причиной его более низкой активности.
По состоянию на 2013 год в литературе не сообщалось о дальнейших антибактериальных исследованиях синтетических или биосинтетических производных боттромицина. Поиск эффективных аналогов будет возможен благодаря статусу боттромицина как рибосомального пептида. Аналоги могут быть исследованы биосинтетически путем изменения последовательности предшественника пептида; изменение аминокислотной последовательности приведет непосредственно к модифицированной структуре боттромицина.
По состоянию на 2013 год боттромицин не был одобрен для каких-либо клинических применений и не был испытан на людях. Стабильность боттромицина in vivo должна быть улучшена, прежде чем его можно будет рассматривать в качестве кандидата на лекарство. Работа Кобаяши и коллег уже началась для решения этой проблемы, но, возможно, будет продолжена. Необходимость поиска новых антибиотиков для борьбы с устойчивостью к антибиотикам означает, что биологический и синтетический интерес к боттромицину, вероятно, сохранится. Сочетание биологических и синтетических методов может дать как эффективный, так и стабильный аналог боттромицина для разработки в качестве потенциального кандидата на лекарство.