В молекулярном клонировании вектор — это любая частица (например, плазмиды , космиды , лямбда-фаги ), используемая в качестве транспортного средства для искусственного переноса чужеродной нуклеиновой последовательности — обычно ДНК — в другую клетку , где она может быть реплицирована и/или экспрессирована . [1] Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантной ДНК . Четыре основных типа векторов — плазмиды , вирусные векторы , космиды и искусственные хромосомы . Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды. [2] Общими для всех сконструированных векторов являются начало репликации , сайт мультиклонирования и селективный маркер .
Сам вектор обычно несет последовательность ДНК , которая состоит из вставки (в данном случае трансгена ) и более крупной последовательности, которая служит «основой» вектора. Целью вектора, который переносит генетическую информацию в другую клетку, обычно является выделение, размножение или экспрессия вставки в целевой клетке. Все векторы могут использоваться для клонирования и, следовательно, являются клонирующими векторами , но есть также векторы, разработанные специально для клонирования, в то время как другие могут быть разработаны специально для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белка. Векторы, разработанные специально для экспрессии трансгена в целевой клетке, называются векторами экспрессии и, как правило, имеют промоторную последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. Более простые векторы, называемые векторами транскрипции, способны только транскрибироваться, но не транслироваться: они могут реплицироваться в целевой клетке, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для амплификации своей вставки.
Манипуляции с ДНК обычно проводятся на векторах E. coli , которые содержат элементы, необходимые для их поддержания в E. coli . Однако векторы могут также иметь элементы, которые позволяют им поддерживаться в другом организме, таком как дрожжи, клетки растений или млекопитающих, и эти векторы называются челночными векторами . Такие векторы имеют бактериальные или вирусные элементы, которые могут быть переданы небактериальному организму-хозяину, однако другие векторы, называемые интрагенными векторами, также были разработаны, чтобы избежать передачи любого генетического материала от чужеродного вида. [3]
Введение вектора в клетку-мишень обычно называют трансформацией для бактериальных клеток [4], трансфекцией для эукариотических клеток [5] , хотя введение вирусного вектора часто называют трансдукцией. [6]
Плазмиды — это двухцепочечные внехромосомные и, как правило, кольцевые последовательности ДНК, способные к репликации с использованием репликационного аппарата клетки-хозяина. [7] Плазмидные векторы в минимальном объеме состоят из точки начала репликации , которая допускает полунезависимую репликацию плазмиды в хозяине. Плазмиды широко распространены во многих бактериях, например, в Escherichia coli , но также могут быть обнаружены в некоторых эукариотах, например, в дрожжах, таких как Saccharomyces cerevisiae . [8] Бактериальные плазмиды могут быть конъюгативными/трансмиссивными и неконъюгативными:
Плазмиды со специально сконструированными характеристиками обычно используются в лабораторных условиях для клонирования . Эти плазмиды, как правило, неконъюгативные, но могут иметь гораздо больше характеристик, в частности, « множественный сайт клонирования », где множественные сайты расщепления ферментом рестрикции позволяют вставлять трансгенную вставку. Бактерии, содержащие плазмиды, могут генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий за часы, а амплифицированные векторы могут быть извлечены из бактерий для дальнейших манипуляций. Плазмиды могут использоваться специально в качестве векторов транскрипции, и такие плазмиды могут не иметь критических последовательностей для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белка, называемые векторами экспрессии , будут включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы , стартовые и стоп-кодоны .
Вирусные векторы — это генетически сконструированные вирусы, несущие модифицированную вирусную ДНК или РНК, которая была сделана неинфекционной, но все еще содержит вирусные промоторы и трансген, что позволяет транслировать трансген через вирусный промотор. Однако, поскольку вирусные векторы часто не имеют инфекционных последовательностей, им требуются вспомогательные вирусы или упаковочные линии для крупномасштабной трансфекции. Вирусные векторы часто разрабатываются для постоянного включения вставки в геном хозяина и, таким образом, оставляют различные генетические маркеры в геноме хозяина после включения трансгена. Например, ретровирусы оставляют характерный ретровирусный паттерн интеграции после вставки, который можно обнаружить и который указывает на то, что вирусный вектор включился в геном хозяина.
Искусственные хромосомы — это изготовленные хромосомы в контексте искусственных хромосом дрожжей (YAC), бактериальных искусственных хромосом (BAC) или человеческих искусственных хромосом (HAC). Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы. [9] YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурных необходимости искусственной хромосомы включают начало репликации, центромеру и последовательности концевых теломер. [10]
Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда требуется экспрессия гена: один ген может быть амплифицирован посредством транскрипции для генерации нескольких копий мРНК , шаблона, на котором белок может быть произведен посредством трансляции. [11] Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, и сколько копий мРНК будет сгенерировано, зависит от промотора, используемого в векторе. [12] Экспрессия может быть конститутивной, что означает, что белок производится постоянно в фоновом режиме, или она может быть индуцируемой, когда белок экспрессируется только при определенных условиях, например, при добавлении химического индуктора. Эти два различных типа экспрессии зависят от типов используемых промотора и оператора .
Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно надежно вызывают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах. [13] Индуцируемая экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, промотор вируса опухоли молочной железы мышей инициирует транскрипцию только после применения дексаметазона , а промотор теплового шока дрозофилы инициирует только после высоких температур.
Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например, для производства мРНК in vitro . Эти векторы называются векторами транскрипции. В них могут отсутствовать последовательности, необходимые для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для производства белка.
Векторы экспрессии производят белки посредством транскрипции вставки вектора с последующей трансляцией произведенной мРНК , поэтому им требуется больше компонентов, чем более простым векторам, работающим только на транскрипцию. Экспрессия в другом организме-хозяине потребует разных элементов, хотя у них есть схожие требования, например, промотор для инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и сигналы терминации.
Векторам экспрессии эукариот требуются последовательности, которые кодируют:
Современные искусственно созданные векторы содержат основные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, присутствующие только в некоторых векторах:
