Вирус хлоротической крапчатости коровьего гороха , известный под аббревиатурой CCMV, — это вирус , который специфически заражает растение коровьего гороха, или черноглазый горох . На листьях инфицированных растений появляются желтые пятна, отсюда и название «хлоротичный». Подобно своему «братскому» вирусу, вирусу мозаики коровьего гороха (CPMV), CCMV вырабатывается в растениях с большим выходом. В естественном хозяине вирусные частицы могут вырабатываться в количестве 1–2 мг на грамм инфицированной листовой ткани. Принадлежащий к роду бромовирусов, вирус хлоротической крапчатости коровьего гороха (CCMV) — это небольшой сферический вирус растений. Другие члены этого рода включают вирус мозаики костра (BMV) и вирус крапчатости бобов (BBMV).
Банкрофт и др. в 1967 году описали первые эксперименты по выделению и характеристике вируса. С тех пор, из-за относительной легкости, с которой он выращивается и выделяется, многие исследователи сосредоточили свое внимание на вирусе. Интерес научного сообщества к этому вирусу также обусловлен заметным свойством: можно разобрать вирус и удалить генетический материал, РНК. Затем, при слегка кислом pH и с относительно высоким содержанием солей, можно стимулировать самосборку белковых субъединиц в оболочку, идентичную по размеру вирусу. Это дает пустой капсид, который обладает рядом интересных свойств. Сообщается о нескольких успешных попытках включить другие материалы, такие как неорганические кристаллы, внутрь капсида. Это может привести к возможным лекарственным методам лечения в будущем. [ необходима цитата ]
CCMV состоит из икосаэдрического белкового капсида (T=3) [1] , диаметр которого составляет 28 нм. Этот капсид состоит из 180 идентичных белковых субъединиц, каждая из которых имеет первичную структуру из 190 аминокислотных остатков. В оболочке вируса распределены три субъединицы: A, B и C. Субъединицы A организованы в пентамеры, а субъединицы B и C организованы вместе в гексамеры. Вирусная оболочка состоит из 12 пентамеров и 20 гексамеров. Внутри капсида находится геном (+)ssRNA, состоящий примерно из 3000 нуклеотидов. [2] Геном разделен на три части (РНК-1-3) с субгеномной частью, называемой РНК4. [1] РНК-1 с большой плотностью окружена собственным капсидом. РНК-2 с малой плотностью также имеет собственный капсид. Поскольку РНК-3 и РНК-4 имеют среднюю плотность, они инкапсулируются вместе. Считается, что РНК-1 и РНК-2 участвуют в репликации вируса, в то время как РНК-3 играет роль в распространении инфекции по всему растению. [3] Когда РНК-3 дефицитна, репликация вируса все равно происходит, просто на значительно сниженном уровне. Из-за этих четырех видов одноцепочечных молекул РНК с положительным смыслом геном CCMV кодирует четыре отдельных гена. [2]
Липофектамин — это реагент, используемый в лаборатории для помощи в трансфекции, позволяющий чужеродной ДНК проникать в целевую клетку. В исследовании Гарманна и др. они обнаружили, что вирусные капсиды CCMV очень прочны и остаются неповрежденными даже после обработки РНКазой в отсутствие липофектамина. [2]
О взаимодействии вируса растения и клетки-хозяина известно немного из-за сложности изучения организмов с клеточными стенками. В одном исследовании изучалось взаимодействие между CCMV и протопластами коровьего гороха и было обнаружено, что оно зависит от неспецифического связывания, в основном опираясь на электростатические взаимодействия между плазматической мембраной и вирусными частицами, в частности отрицательно заряженными везикулами и положительно заряженным N-концевым плечом вирусных белков оболочки, что дополнительно маркирует CCMV как эндоцитарный вирус. Он также использует мембранные повреждения для внедрения вирусных частиц в клетку. В целом, наиболее эффективное заражение происходит путем интернализации через мембранные повреждения хозяина. [4]
Один специфический белок, ORF3a, является белком движения, присутствующим в геноме CCMV, который помогает транспортировать вирусный геном в соседние растительные клетки с помощью плазмодесм. Это позволяет вирусу обходить барьер стенки клетки хозяина и эффективно заражать хозяина. Движение CCMV не требует почкования, поскольку структуры трубочек увеличивают плазмодесмы достаточно, чтобы обеспечить прямой проход вирусного капсида через клеточную стенку. [5]
Типичная вирусная инфекция включает экспоненциальное увеличение концентрации вируса с последующим быстрым снижением репликации вируса. При наличии дефицита РНК 3 репликация вируса все еще происходит, просто на значительно сниженном уровне. Также считается, что это отвечает за низкое соотношение белка оболочки к вирусной РНК. [ необходима цитата ]
После проникновения вируса белковый капсид разрушается клеткой-хозяином, и это позволяет распаковать вирусную РНК. РНК1 и РНК2 кодируют белок 1a и 2a-полимеразу соответственно, оба из которых экспрессируются для производства вирусных репликационных белков внутри клетки. [6] Фактический процесс репликации происходит в мембранных везикулах, созданных из инвагинаций мембраны эндоплазматического ретикулума хозяина. Вирусная РНК реплицируется в геном dsRNA с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы. Недавно синтезированная dsRNA используется как для транскрипции большего количества (+)ssRNA из шаблонной цепи (-)РНК, так и существующая цепь (+)РНК реплицируется для производства множества копий для использования в качестве транслируемой мРНК. Во время этого процесса субгеномная РНК4 также транслируется для производства вирусных капсидных белков. Используя недавно синтезированные копии (+)ssRNA и капсидных белков, вирус собирается внутри везикулы. [7]
При совместном заражении клеток растения-хозяина двумя различными мутантами делеции гена CCMV функциональные геномы РНК-вируса могут быть восстановлены путем гомологичной рекомбинационной репарации. [8] Механизм рекомбинации, вероятно, заключается в переключении нитей (выборе копии) во время репликации вирусной РНК. Скорость и частота этой рекомбинации предполагают, что такое спасение генома, вероятно, имеет важное значение в естественных популяциях CCMV. [8]
Сборка вируса является ключом к его эффективности, поскольку он должен быть как достаточно стабильным, чтобы защитить свой геном перед проникновением в клетку, так и достаточно лабильным, чтобы высвобождать свое генетическое содержимое в целевую клетку по мере разборки. Одноцепочечная РНК пропускается через небольшие поры, уже имеющиеся в капсиде. При нейтральном pH капсидный белок обратимо связывается с РНК, образуя прекапсидный комплекс. Он состоит из РНК, окруженной достаточным количеством капсидных белков (CP), чтобы нейтрализовать отрицательные заряды фосфатного остова РНК. Когда происходит подкисление, происходит необратимое конформационное изменение, в результате чего получается конечный продукт икосаэдрического капсида. Это делается путем отправки любых избыточных CP из РНК наружу нового капсида. Этот процесс зависит от основности CP из-за его N-концевого мотива, богатого аргинином (ARM), и внешней отрицательной плотности заряда капсида. Капсидный белок также участвует в перемещении вируса, передаче, проявлении симптомов и целевых хозяевах. [9] Как было показано выше, сборка CCMV является зависимым от pH механизмом, как и разборка. При pH 5 CCMV стабилен, но при pH 7,0 и без ионов, таких как Ca2+ или Mg2+, происходит набухание диаметра капсида. Это создает отверстия в капсиде, но вирусная РНК в это время не высвобождается, что позволяет обратить этот процесс вспять. Это важно, поскольку было обнаружено, что ионы кальция необходимы для стабильности вируса. Хотя РНК не высвобождается спонтанно, когда происходит набухание и вирус находится в подходящей для заражения среде, набухание вызовет высвобождение РНК в цитоплазму целевой клетки. [10]
На рисунке справа показан вирус CCMV в кислой среде (a) и вирус CCMV при изменении pH и возникновении отека (b), что обеспечивает электростатические взаимодействия, что еще больше усиливает способность вируса заражать хозяина. [ необходима ссылка ]
Было замечено, что этот вирус заражает только растительные клетки, в частности коровий горох. Основным наблюдаемым симптомом CCMV является яркий хлороз или желтая окраска листьев растения, известная как штамм CCMV-T. Этот хлороз наблюдался как менее серьезный эффект, вызывая светло-зеленую окраску при заражении растений ослабленным штаммом, называемым CCMV-M. Результаты эксперимента, проведенного де Ассисом Филхо и др., показали, что этот первичный симптом был вызван аминокислотой в позиции 151 белка оболочки капсида. [11]
Было обнаружено, что вирус CCMV передается фасолевой листоедкой Cerotoma trifurcata и пятнистым огуречным жуком Diabrotica undecimpunctata howardii . Вирус CCMV поражает фасоль и коровий горох, но было обнаружено, что репликация вируса происходит гораздо активнее, когда вирус приобретается и передается фасоли, а не коровьему гороху. [12]
Как обсуждалось в разделе «Сборка и высвобождение», CCMV стабилизируется кислыми условиями (pH = 5,0). Таким образом, считается, что кишечник насекомых обеспечивает кислые условия, позволяющие CCMV передаваться и сохранять стабильность. [13]
В декабре 2018 года репликация CCMV была полностью восстановлена в Saccharomyces cerevisiae , типе дрожжей. В этом эксперименте было обнаружено, что белок 1a был единственным вирусным фактором, необходимым для индуцирования инвагинации эндоплазматического ретикулума и начала процесса репликации. Было обнаружено, что полимераза 2a рекрутируется белком 1a после образования репликационной сферулы. Было обнаружено одно ограничение для репликации CCMV в S. cerevisiae , и это было связано с отсутствием репликации РНК-3. Значимость этого эксперимента выходит за рамки результатов, поскольку S. cerevisiae является популярным модельным организмом для вирусной инокуляции и может открыть пути для дальнейших исследований с CCMV. [6]
Следующие вирусы тесно связаны с вирусом CCMV и являются представителями рода Bromovirus: [14]
{{cite book}}: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на ноябрь 2024 г. ( ссылка )