stringtranslate.com

Изоляция клеток

Выделение клеток — это процесс отделения отдельных живых клеток от твердого блока ткани или клеточной суспензии. Хотя некоторые типы клеток в природе существуют в отдельной форме (например, клетки крови ), другие типы клеток, обнаруженные в твердых тканях, требуют специальных методов для разделения их на отдельные клетки. Это можно сделать, используя ферменты для переваривания белков , которые связывают эти клетки вместе во внеклеточном матриксе . После переваривания белков матрикса клетки остаются слабо связанными друг с другом, но их можно аккуратно разделить механическим путем. После выделения на этих отдельных изолированных клетках можно проводить эксперименты, включая электрофизиологию патч-клампа , флуоресцентную визуализацию кальция и иммуноцитохимию . 

Техники

Изображение изолированных взрослых кардиомиоцитов , полученное с помощью конфокальной микроскопии

Циркулирующие клетки

Методы, необходимые для получения изолированных клеток, различаются в зависимости от требуемого типа клеток. Циркулирующие клетки, такие как клетки крови или некоторые опухолевые клетки, можно выделить, взяв образец крови. [1] Поскольку образцы крови содержат смесь многих различных типов клеток, необходимо использовать метод разделения клеток на разные типы. Наиболее часто используемый для этого метод — проточная цитометрия , во время которой автоматический анализатор исследует узкий поток клеток. В одной из версий этого метода поток клеток освещается светом, и анализатор обнаруживает отраженный свет или флуоресценцию, прежде чем использовать эту информацию для быстрого перемещения интересующих клеток в камеру для сбора. [2]

Твердые ткани

При работе с твердыми тканями получение ткани для выделения клеток может оказаться более сложной задачей. Излишки человеческой ткани иногда можно получить во время плановой операции, например, образцы ушка правого предсердия часто вырезают и выбрасывают во время операции на открытом сердце, такой как операция аортокоронарного шунтирования . [3]  Для биопсии могут быть взяты другие ткани, такие как образцы поджелудочной железы или мочевого пузыря. Альтернативно, ткани животных часто получают путем умерщвления животного. [4]

После получения образца ткани его необходимо окружить или пропитать раствором соответствующей температуры, содержащим соли и питательные вещества, необходимые для поддержания жизни клеток. Это может быть выполнено путем простого погружения ткани в раствор или может включать более сложные процедуры, такие как перфузия Лангендорфа . [3] Обычно используемые растворы включали модификации раствора Тирода или раствора Кребса и Хенселейта. Эти растворы содержат точные концентрации электролитов, включая натрий , калий , кальций , магний , фосфат , хлорид и глюкозу . Концентрации этих электролитов необходимо тщательно балансировать, обращая внимание на осмотическое давление. Кислотность раствора необходимо регулировать, часто используя буфер pH, такой как HEPES . Выделение клеток из некоторых тканей можно улучшить путем насыщения раствора кислородом. [3] На начальных стадиях перфузия ткани раствором, не содержащим кальция, особенно полезна при выделении кардиомиоцитов , поскольку отсутствие кальция вызывает разделение вставочных дисков . [5]

Затем к раствору можно добавить протеолитические ферменты . Ферменты, расщепляющие коллаген ( коллагеназы ), часто используются при выделении клеток сердца или мочевого пузыря. [3] [4] [6] Также можно использовать ферменты общего назначения, которые переваривают многие виды белков ( протеазы ). [3] При выделении клеток из ткани головного мозга могут потребоваться другие ферменты, расщепляющие ДНК (ДНКазы). [7]

Эти ферменты, помимо переваривания внеклеточного матрикса, могут также переваривать другие важные белки, необходимые для функционирования интересующих клеток. Если клетки подвергаются воздействию этих ферментов слишком долго, это приводит к гибели клеток, но если они не подвергаются воздействию ферментов достаточно долго, переваривание внеклеточного матрикса не будет полным. После удаления ферментов из ткани путем перфузии ее вторым раствором, не содержащим ферментов, клетки можно механически разделить или диссоциировать. Простой метод диссоциации клеток предполагает разрезание ткани на небольшие кусочки перед перемешиванием этих кусочков в растворе с помощью пипетки. [3] [4]

Использование

Изолированные клетки можно использовать для изучения того, как они работают, как они изменяются в ответ на болезнь и как на них влияют лекарства. Примером экспериментальной техники, в которой используются изолированные клетки, является электрофизиология с использованием патч-клампа , используемая для изучения того, как заряженные частицы проходят через клеточную мембрану . Дополнительные методы включают флуоресцентную визуализацию кальция с использованием красителей, которые излучают свет в ответ на кальций для измерения того, как кальций регулируется внутри клетки, и иммуноцитохимию , которая использует антитела, помеченные флуоресцентным маркером, для определения местоположения белков внутри клетки. [8] Изолированные клетки также можно использовать для клеточной культуры , при которой одна клетка размножается для создания колонии клеток. [4]

Выделение клеток также можно использовать как часть лечения. Выделение островковых клеток поджелудочной железы с последующим их культивированием и трансплантацией используется для лечения пациентов с диабетом 1 типа . [9]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Бхагват Н., Карпентер Э.Л. (2017). «Проточные цитометрические методы выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Выделение и молекулярная характеристика циркулирующих опухолевых клеток . Достижения экспериментальной медицины и биологии. Том. 994. стр. 105–118. дои : 10.1007/978-3-319-55947-6_5. ISBN 978-3-319-55946-9. ПМИД  28560670.
  2. ^ Ху П., Чжан В., Синь Х., Дэн Г. (2016). «Выделение и анализ одиночных клеток». Границы клеточной биологии и биологии развития . 4 : 116. дои : 10.3389/fcell.2016.00116 . ПМК 5078503 . ПМИД  27826548. 
  3. ^ abcdef Фойгт Н., Пирман К.М., Добрев Д., Дибб К.М. (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток крупных млекопитающих и человека». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2015.07.006 . ПМИД  26186893.
  4. ^ abcd Louch WE, Шихан К.А., Вольска Б.М. (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2011.06.012. ПМК 3164875 . ПМИД  21723873. 
  5. ^ Йейтс Дж.К., Дхалла Н.С. (февраль 1975 г.). «Структурные и функциональные изменения, связанные с недостаточностью и восстановлением сердца после перфузии средой, не содержащей Са2+». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 7 (2): 91–103. дои : 10.1016/0022-2828(75)90011-5. ПМИД  1121035.
  6. ^ Клосковский Т, Узарска М, Гуртовска Н, Ольковска Дж, Иоахимяк Р, Баек А, Гагат М, Гржанка А, Боднар М, Маршалек А, Древа Т (апрель 2014 г.). «Как изолировать уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Человеческая клетка . 27 (2): 85–93. дои : 10.1007/s13577-013-0070-y. PMID  24368576. S2CID  9966872.
  7. ^ Чу Ж.Дж., ДеБой Калифорния, Сенаторов В.В. (октябрь 2014 г.). «Определение степени разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию». Журнал методов нейробиологии . 236 : 125–47. doi :10.1016/j.jneumeth.2014.08.017. ПМК 4171043 . ПМИД  25169049. 
  8. ^ Фрэнк, Дж.; Бисальски, Гонконг; Доминичи, С.; Помпелла, А. (январь 2000 г.). «Визуализация окислительного стресса в тканях и изолированных клетках». Гистология и гистопатология . 15 (1): 173–184. дои : 10.14670/HH-15.173. ISSN  0213-3911. ПМИД  10668208.
  9. ^ Киффер Т.Дж., Вольтьен К., Осафунэ К., Ябэ Д., Инагаки Н. (октябрь 2017 г.). «Стратегии замены бета-клеток при диабете». Журнал исследования диабета . 9 (3): 457–463. дои : 10.1111/jdi.12758. ПМЦ 5934267 . ПМИД  28984038. 

дальнейшее чтение