Первым шагом транскрипции для некоторых отрицательных одноцепочечных РНК-вирусов является кэп-снэтчинг , при котором первые 10–20 остатков РНК клетки-хозяина удаляются (снэтчируются) и используются в качестве 5′ -кэпа и праймера для инициирования синтеза зарождающейся вирусной мРНК. [1] Затем вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) может приступить к транскрипции положительно-полярной вирусной мРНК, используя отрицательно-полярную вирусную РНК в качестве матрицы. Кэп-снэтчинг также объясняет, почему некоторые вирусные мРНК имеют 5′-концевые расширения из 10–20 нуклеотидов, которые не закодированы в геноме. Примерами вирусов, которые участвуют в кэп-снэтчинге, являются вирусы гриппа ( Orthomyxoviridae ), вирус Ласса ( Arenaviridae ), вирус Хантаан ( Hantaviridae ) и вирус лихорадки долины Рифт ( Phenuiviridae ). Большинство вирусов захватывают 15–20 нуклеотидов, за исключением семейств Arenaviridae и Nairoviridae , а также рода Thogotovirus ( Orthomyxoviridae ), которые используют более короткую цепь. [2]
В вирусе гриппа кэп-схватывание происходит в ядре клетки. Функция кэп-схватывающей эндонуклеазы содержится в субъединице PA РНК -полимеразы . [3]
У Arenaviridae и Bunyavirales захват колпачка происходит в цитоплазме. [4]
Кража крышек происходит в три основных этапа:
1) Вирусный белок RdRp или N связывается с 5'-метилированной структурой cap-1 или cap-2 мРНК хозяина.
2) Вирусная эндонуклеаза расщепляет мРНК на несколько нуклеотидов ниже кэпа.
3) Кэпированная РНК используется в качестве праймера для инициации синтеза вирусной мРНК, осуществляемого RdRp. [2]
Срывание колпачка лучше всего описано у вирусов гриппа, особенно у гриппа А. У Orthomyxoviridae , вирусного семейства гриппа, RdRp делится на три субъединицы: PA, PB1 и PB2.
PB1 сначала связывает 5'-конец вирусной РНК (vRNA), активируя PB2 и заставляя 3'-конец vRNA образовывать двухцепочечную зону с 5'-концом. PB2 продолжает связывать клеточную мРНК на 5'-конце, закрытом N7-метилгуанозином (m 7 G). Субъединица PA впоследствии расщепляет последовательность 10-13 нуклеотидов от структуры кэпа посредством эндонуклеазной активности на N-конце. [5] Точное место расщепления зависит как от расстояния между PB2 и PA RdRp (около 50 ангстрем или 10-13 нуклеотидов), так и от последовательности мРНК. Затем субъединица PB1, которая содержит полимеразную активность, первоначально добавляет два новых нуклеотида. Праймер с кэпом перемещается через туннель выхода продукта в домене PB1, чтобы служить праймером для транскрипции. Нуклеотиды vRNA 3'-UCGUUUU не связаны с полимеразой, а свободны для комплементарного связывания с кэпированным праймером РНК для обеспечения стабильности. Затем транскрипция начинается с остатка G или C на 3'-конце кэпированного праймера. [6] Наконец, субъединица PB1 завершает удлинение цепи в каноническом направлении от 5' до 3', освобождая кэп, но сохраняя 5'-конец связанным. Вирусный 3' поли-A-хвост добавляется в конце транскрипции за счет застревания полимеразы из-за стерического препятствия петли vRNA. [7] Полученная вирусная мРНК выглядит идентично мРНК хозяина, что позволяет эндогенным клеточным механизмам выполнять процессинг и ядерный экспорт.
Декэпированные мРНК хозяина подвергаются целенаправленной деградации, что приводит к снижению регуляции клеточной мРНК. RdRp гриппа также взаимодействует с C-терминальным доменом клеточной полимеразы II (Pol II), что потенциально способствует вирусной транскрипции путем изменения конформации RdRp. Кроме того, уменьшая распространенность Pol II, грипп может начать отключать критическую транскрипцию хозяина. [8]
Cap snatching не используется во время репликации. Вместо этого RdRp выполняет шаг «prime and realign», гарантируя, что геном полностью скопирован. В этом механизме RdRp устанавливает праймер внутри, затем vRNA перестраивается для продолжения репликации. [9]
Домен связывания крышки PB2 вируса гриппа имеет уникальную складчатость, но он использует ароматическую укладку для выполнения связывания крышки m 7 G, аналогично другим белкам связывания крышки. PA является членом семейства нуклеаз PD(D/E)XK, которое использует двухвалентные ионы металлов для расщепления нуклеиновой кислоты. Однако у него есть специфический остаток гистидина активного центра, который лигирует ион Mn2+, используемый для расщепления. [5]
В октябре 2018 года FDA США одобрило балоксавир марбоксил для лечения острого неосложненного гриппа , что стало первым новым классом противовирусных препаратов против гриппа за последние два десятилетия. [10] Препарат использует знания о захвате колпачка путем нацеливания и ингибирования эндонуклеазной функции субъединицы PA, что не позволит вирусу инициировать транскрипцию. Балоксавир марбоксил (Xofluza) эффективен против гриппа A и B. [11]
Семейство Arenaviridae и отряд Bunyavirales также являются сегментированными негативными одноцепочечными РНК-вирусами. Подтвержденная зависимая от Mn 2+ эндонуклеаза расположена на N-конце белка L. TN-концевой домен сохраняется между различными семействами, что предполагает эволюционное сходство. Однако домен связывания кэпа не подтвержден для каждого семейства вирусов, но считается, что он расположен в белке L или нуклеокапсида (N или NP).[1] У bunyavirales предпочтения в расщеплении эндонуклеаз и нуклеотидных мотивах различаются между семействами, родами и видами. Это изменение происходит из-за необходимости некоторого спаривания оснований с 3'-концом вирусного генома. [7]
Структура нуклеопротеина в вирусе Ласса ( Arenaviridae ) содержит вторую нуклеазу. Исследователи предполагают, что она участвует в ослаблении реакции интерферона, но она также содержит сайт связывания dTTP, который может использоваться для захвата колпачка. В этой модели белки L и N взаимодействуют в процессе захвата колпачка. Двухдоменная модель также была предложена для хантавирусов, но белок N в вирусе лихорадки долины Рифт ( Phenuiviridae ) не обладает теми же характеристиками. [12]
Срыв кэпа также был подробно исследован для семейства Hantaviridae ( Bunyavirales ). Есть доказательства того, что белок N связывается с 5'-кэпом и защищает их от деградации клеточными механизмами. Белок N накапливается в цитоплазматических клеточных процессинговых тельцах (P-тельцах), секвестируя защищенные 5'-кэпы в качестве пула доступных праймеров для RdRp, чтобы начать синтез вирусной мРНК. На vRNA есть четыре нуклеотида, которые примыкают к 5'-кэпу для связывания. Вирус предпочтительно расщепляет кэп мРНК на остатке G в 14 нуклеотидах ниже по течению от кэпа. Кроме того, он обычно расщепляет кэпы с бессмысленной мРНК вместо активно транслируемой мРНК. Белок N может защищать кэпы мРНК хозяина без P-тел, но они не используются RdRp так эффективно. [13]
Hantaviridae RdRp также может участвовать в механизме «затравки и перестройки»: олигонуклеотид хозяина затравливает транскрипцию мРНК и инициирует транскрипцию с помощью терминального остатка G. После добавления нескольких нуклеотидов зарождающаяся РНК перестраивается, перемещая два нуклеотида назад на повторяющейся терминальной последовательности (AUCAUCAUC) , так что G хозяина снова становится первым нуклеотидом, создавая 5'-концевое расширение. [14]