Митотический выход является важной точкой перехода, которая означает конец митоза и начало новой фазы G1 для клетки, и клетка должна полагаться на определенные механизмы контроля, чтобы гарантировать, что после выхода из митоза она никогда не вернется в митоз, пока не пройдет фазы G1, S и G2 и не пройдет все необходимые контрольные точки. Многие факторы, включая циклины , циклинзависимые киназы (CDK), убиквитинлигазы , ингибиторы циклинзависимых киназ и обратимые фосфорилирования , регулируют митотический выход, чтобы гарантировать, что события клеточного цикла происходят в правильном порядке с наименьшим количеством ошибок. [1] Конец митоза характеризуется разрывом веретена, укороченными кинетохорными микротрубочками и выраженным разрастанием астральных (некинетохорных) микротрубочек. Для нормальной эукариотической клетки митотический выход необратим. [2]
Было высказано много предположений относительно механизмов контроля, используемых клеткой для содействия необратимости митотического выхода в модельном эукариотическом организме, почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae . Протеолитическая деградация регуляторов клеточного цикла и соответствующие эффекты на уровни циклин-зависимых киназ были предложены в качестве механизма, который способствует эукариотическому клеточному циклу и переходу от метафазы к анафазе в частности. В этой теории комплекс, способствующий анафазе (APC), класс убиквитинлигаз, способствует деградации митотических циклинов (Clb2) и факторов, ингибирующих анафазу (PDS1, CUT2), для содействия митотическому выходу. [3] APC убиквитинирует мотив из девяти аминокислот, известный как деструктивный бокс (D-бокс), в NH2-концевом домене митотических циклинов для деградации протеасомой. [3] APC в ассоциации с Cdc20 (APC-Cdc20) убиквитинирует и нацеливает митотические циклины (Clb2) для деградации на начальной фазе. Одновременно APC-Cdc20 опосредует деградацию секуринов , которые ингибируют сепаразы посредством связывания в начале анафазы. Высвобожденная и активная сепараза расщепляет когезин, который удерживал сестринские хроматиды вместе, облегчая разделение сестринских хроматид и инициирует митотический выход, способствуя высвобождению Cdc14 из ядрышка. [4] [5] На более поздней фазе подавление Cdk1 и активация Cdc14, фосфатазы, активирующей Cdh1, способствуют образованию APC в ассоциации с Cdh1 (APC-Cdh1) для деградации Clb2s. [2] Cdc20 и Cdh1, которые являются активаторами APC, привлекают такие субстраты, как секурин и циклины B-типа (Clb) для убиквитинирования. [6] Без комплексов Cdk1-Clb2 для фосфорилирования белков, которые участвуют в динамике веретена, таких как Sli15, Ase1 и Ask1 , происходит удлинение веретена и сегрегация хромосом, что облегчает выход из митоза. [2] Важность протеолитической деградации в эукариотическом клеточном цикле изменила взгляд на деление клеток как на простой каскад киназ, на более сложный процесс, в котором необходимы взаимодействия между фосфорилированием, убиквитинированием и протеолизом. [3] Однако эксперименты с использованием почкующихся дрожжевых клеток с cdc28-as1, чувствительным к INM-PP1 (аналог АТФ) аллелем Cdk, доказали, что разрушение циклинов B-типа (Clb) не является необходимым для запуска необратимого митотического выхода. [2]Деградация Clb2 действительно сократила период ингибирования Cdk1, необходимый для запуска необратимого митотического выхода, что указывает на то, что протеолиз циклина вносит вклад в динамическую природу эукариотического клеточного цикла из-за более медленного времени его действия, но вряд ли является основным определяющим фактором в запуске необратимых переходов клеточного цикла. [2]
Были сделаны открытия, которые указали на важность уровня ингибиторов циклинзависимых киназ в регуляции эукариотического клеточного цикла. В частности, было показано, что уровень Sic1 , стехиометрического ингибитора комплексов Clb-CDK в почкующихся дрожжах, особенно важен в необратимом переходе G1-S путем необратимой активации киназ S-фазы. [7] Было показано, что уровень Sic1 играет важную роль в запуске необратимого митотического выхода (переход M-G1), а также в переходе G1-S. Во время митоза снижение уровня Cdk1 приводит к активации Cdc14, фосфатазы, которая противодействует Cdk1 посредством активации Cdh1 и Swi5, транскрипционного активатора белков Sic1. [8] В то время как деградация Sic1 до определенного низкого уровня запускала начало S-фазы, накопление Sic1 до определенного высокого уровня требовалось для запуска необратимого митотического выхода. [2] Ингибиторы Cdk1 могут вызывать митотический выход, даже когда деградация циклинов B-типа блокируется экспрессией недеградируемых Clbs или ингибиторов протеасом. Однако сестринские хроматиды не разделяются, и клетки возвращаются к митозу после того, как ингибиторы смываются, что указывает на необходимость достижения порогового уровня ингибиторов для запуска необратимого митотического выхода независимо от деградации циклинов. [9] Несмотря на различные пороговые значения уровня Sic1, необходимые для запуска митотического выхода по сравнению с переходом G1-S, было показано, что уровень Sic1 играет ключевую роль в регуляции эукариотического клеточного цикла путем ингибирования активности CDK.
Поскольку эукариотический клеточный цикл включает в себя множество белков и регуляторных взаимодействий, можно использовать динамический системный подход для упрощения сложной биологической цепи в общую структуру для лучшего анализа. [10] [11] Среди четырех возможных отношений ввода/вывода отношение между уровнем Sic1 и митотическим выходом, по-видимому, демонстрирует характеристики необратимого бистабильного переключения, управляемого обратной связью между APC-Cdh1, Sic1 и Clb2-Cdk1. [2] Известно, что бистабильность контролирует биологические функции, такие как контроль клеточного цикла и клеточная дифференциация, и играет ключевую роль во многих клеточных регуляторных сетях. [12] Бистабильное отношение ввода/вывода характеризуется двумя стабильными состояниями с двумя точками бифуркации. Для одного конкретного входа в области бистабильности, отмеченной двумя точками бифуркации, возможны множественные выходы. Кроме того, бистабильное отношение демонстрирует гистерезис: конечное состояние/выход зависит от истории входа, а также от текущего значения входа, поскольку у системы есть память. [10] Одна точка бифуркации имеет отрицательное значение контрольного параметра (точка бифуркации находится по другую сторону оси), что приводит к разрыву связи между двумя стабильными состояниями и необратимости перехода из одного состояния в другое. Что касается митотического выхода, два стабильных состояния определяются митозом и фазой G1. Как только уровень Sic1 (вход) накапливается выше порогового значения, происходит необратимый переход из митоза (стабильное состояние I) в фазу G1 (стабильное состояние II). В несовершенной среде единственная бифуркация, которая остается нетронутой, — это бифуркация седло-узел . Бифуркация седло-узел не разрушается (седло-узел — ожидаемое общее поведение), в то время как транскритические и вилочные бифуркации разрушаются при наличии несовершенств. [13] Таким образом, единственная одномерная бифуркация, которая может существовать в несовершенном биологическом мире, — это бифуркация седло-узел. [10] Бистабильную связь между переходом M-G1 и уровнем Sic1 можно представить в виде диаграммы двух седло-узловых бифуркаций, в которых поведение системы качественно меняется при небольшом изменении управляющего параметра — величины Sic1.
Поскольку поведение клеточного цикла критически зависит от количества Sic1 в переходном состоянии M-G1, количество Sic1 жестко регулируется обратными связями на системном уровне. Поскольку Cdk1-Clb2 ингибирует Sic1, фосфорилируя Sic1 и делая Sic1 доступным для деградации через убиквитинирование, APC-Cdh1-зависимая деградация Cdk1-Clb2 не только снижает уровень доступных комплексов Cdk1-Clb2, но и увеличивает уровень Sic1, что в свою очередь еще больше ингибирует функцию Cdk1-Clb2. [8] Эта активация двойной отрицательной обратной связи инициируется APC-Cdc20-зависимой деградацией Cdk1-Clb2 и высвобождением Cdc14 из ядрышкового белка Net1/Cfi1. [14] Путь FEAR (выделение Cdc14 в раннюю анафазу) облегчает фосфорилирование Net1, зависящее от Clb2-Cdk1, которое временно высвобождает Cdc14 из Net1. [15] Высвобожденные комплексы Cdc14 и Clb2-Cdk1 переходят в форму веретен, которые активируют сеть митотического выхода (MEN). MEN обеспечивает устойчивое высвобождение Cdc14 из ядрышка, [15] а Cdc14 противодействует активности Clb2-Cdk1, активируя Cdh1 и стабилизируя Sic1 посредством активации транскрипционного активатора Sic1 Swi5. [16] Sic1 положительно регулирует себя, ингибируя Cdk1-Clb2 для высвобождения ингибирования Swi5, и Cdh1 также положительно регулирует себя, ингибируя Clb2-Cdk1 для высвобождения ингибирования MEN, которое может активировать Cdc14 и впоследствии сам Cdh1. Двойная отрицательная обратная связь, образованная APC-Cdh1 и Sic1, необходима для поддержания низкой активности Clb2-Cdk1, поскольку Clb2 автоматически активирует свой синтез, активируя транскрипционные факторы, комплекс Fkh2– Mcm1 Ndd1. [8]
Эукариотический клеточный цикл состоит из различных контрольных точек и петель обратной связи для обеспечения верного и успешного деления клеток. Например, во время митоза, когда дублированные хромосомы неправильно прикреплены к митотическому веретену, белки контрольной точки сборки веретена (SAC), включая Mad и Bub, ингибируют APC-Cdc20, задерживая вступление в анафазу и деградацию циклинов B-типа. Кроме того, когда митотические веретена смещены, MEN и впоследствии Cdc14 ингибируются зависимым от Bub2 и Bfa1 образом, предотвращая деградацию митотических циклинов и вступление в анафазу. [16] Sic1 является хорошим примером, демонстрирующим, как взаимодействуют обратные связи на системном уровне, чтобы определять условия окружающей среды и запускать переходы клеточного цикла. Несмотря на то, что фактический переход M-G1 чрезвычайно сложен с многочисленными вовлеченными белками и регуляциями, динамический системный подход позволяет упростить эту сложную систему до бистабильного отношения ввода/вывода с двумя бифуркациями седло-узла, в которых выход (митотический выход) зависит от критической концентрации Sic1. Используя одномерный анализ, можно объяснить многие необратимые точки перехода в эукариотическом клеточном цикле, которые регулируются контролем и обратной связью на системном уровне. Другие примеры необратимых точек перехода включают Start (необратимое обязательство нового цикла деления клетки), которое можно объяснить необратимым бистабильным переключением, контрольный параметр которого жестко регулируется системными обратными связями, включающими Cln2, Whi5 и SBF. [17]
Регулирование митотического прогрессирования и выхода имеет первостепенное значение, поскольку ошибки в этом процессе могут привести к анеуплоидии и раку. Недавние исследования, в частности, с участием ингибитора Cdk1 флавопиридола, пролили свет на увлекательный аспект обратимости митотического выхода, бросая вызов давним взглядам на однонаправленность переходов клеточного цикла. [18] Центральным для понимания митотического выхода является Cdk1, киназа, которая управляет митотическим прогрессированием. Активируемая связыванием с циклинами, в частности циклинами A и B, активность Cdk1 достигает пика во время митоза. [18] Своевременная деградация этих циклинов, особенно циклина B, имеет решающее значение для митотического выхода. Эта деградация обеспечивает дефосфорилирование субстратов Cdk1, действуя как механизм синхронизации для критического перехода от метафазы к анафазе и, в конечном итоге, к выходу из митоза. Такая тщательная регуляция подчеркивает приверженность клетки необратимости фаз клеточного цикла в нормальных условиях. Введение флавопиридола, мощного ингибитора Cdk1, произвело революцию в понимании митотической регуляции. При применении к клеткам позвоночных во время митоза флавопиридол вызывал преждевременный выход из митоза, сопровождавшийся цитокинезом, но, что примечательно, без предварительного разделения хроматид. [18] Это явление привело к интригующему фенотипу «разрезания», когда хромосомы, хотя и деконденсированные и окутанные новообразованными ядерными мембранами, оставались запертыми в середине тела клетки (рисунок 4). Самым поразительным открытием из исследований флавопиридола является обратимость митотического выхода. Когда активность протеасомы, ответственная за деградацию циклина, ингибируется, эффекты флавопиридола становятся обратимыми. [18] После удаления флавопиридола клетки, ранее вынужденные преждевременно выйти из митоза, могли вернуться в состояние метафазы. Это обращение включает в себя повторную сборку митотического веретена, ретракцию цитокинетической борозды, растворение новообразованной ядерной оболочки и повторную конденсацию хромосом. Обратимость митотического выхода в значительной степени зависит от стабильности циклина B. [18] В условиях, когда циклин B защищен от деградации, например, в присутствии ингибиторов протеасомы, таких как MG132, митотический выход, вызванный флавопиридолом, может быть обращен вспять. [18] Это открытие было дополнительно подтверждено с использованием недеградируемого циклина B1, который показал, что клетки со стабилизированным циклином B могут вернуться в метафазу при удалении флавопиридола, что указывает на прямую корреляцию между стабильностью циклина B и обратимостью митотического выхода. [18]
Исследования рака долгое время фокусировались на нарушении деления клеток как на терапевтической стратегии. Антимитотические препараты, нацеленные на динамику микротрубочек, были краеугольным камнем этого подхода. Однако их успех часто затрудняется побочными эффектами, такими как нейротоксичность и ограниченная эффективность против солидных опухолей. [19] Использование таксанов и алкалоидов барвинка, нацеленных на динамику микротрубочек, было стандартом в терапии рака. Однако их эффективность часто подрывается серьезными побочными эффектами, в частности нейротоксичностью , из-за нарушения микротрубочек в нейронах. Кроме того, веретеноспецифические антимитотические препараты, хотя и менее нейротоксичны, показали ограниченный успех против солидных опухолей, часто сопоставимый или уступающий традиционным препаратам. [19] Этот сценарий подчеркивает необходимость альтернативных антимитотических стратегий, которые являются как более эффективными, так и менее токсичными. Недавние исследования сместили фокус на процесс митотического выхода, в частности, блокируя эту фазу как новую противораковую стратегию. Ключевым игроком в этом контексте является Cdc20, регуляторный белок, который активирует комплекс стимуляции анафазы/циклосому (APC/C), что приводит к деградации циклина B1 и митотическому выходу. Нокдаун Cdc20 с использованием методов РНК-интерференции вызывает длительную остановку митоза, что приводит к гибели клетки. [19] Было показано, что этот подход более эффективен, чем препараты, нарушающие веретено, в уничтожении раковых клеток, включая те, которые устойчивы к апоптозу или склонны к проскальзыванию (избеганию остановки, вызванной лекарством). [19] Нокдаун Cdc20 приводит к устойчивой остановке митоза за счет стабилизации уровней циклина B1, тем самым предотвращая проскальзывание. Эта длительная остановка дает больше времени апоптотическим механизмам для активации и уничтожения раковых клеток. В отличие от препаратов, нарушающих веретено, эта стратегия не полагается на активацию контрольной точки сборки веретена (SAC) и эффективна даже в клетках с дефицитом SAC. [19] Более того, нокдаун Cdc20 вызывает гибель клеток как через зависимые, так и через независимые пути проницаемости митохондриальной наружной мембраны (MOMP), что делает его эффективным против более широкого спектра типов раковых клеток (рисунок 5). [19] Блокада митотического выхода имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными препаратами, нацеленными на веретено. Во-первых, она позволяет избежать нейротоксичности, связанной с нарушением микротрубочек. Во-вторых, ее эффективность не ограничивается активностью SAC или способностью клетки избегать смерти посредством проскальзывания. Наконец, она нацелена на фундаментальную и позднюю стадию деления клеток, потенциально снижая вероятность развития резистентности по сравнению с препаратами, нацеленными на более ранние стадии, такие как сборка веретена. Хотя нацеливание на митотический выход в качестве терапии рака является многообещающим, оно не лишено проблем. Разработка специфических, мощных ингибиторов Cdc20 или других белков митотического выхода является значительным препятствием. [19]Кроме того, ключевым направлением исследований остается понимание точных механизмов, посредством которых длительная остановка митоза вызывает гибель клеток, и выявление потенциальных мишеней для лекарственных препаратов в рамках этих путей.
У почкующихся дрожжей процесс митотического выхода включает сеть белков, которые переплетают концепции клеточной полярности и митотической регуляции. Центральное место в этой сети занимают роли Cdc14, фосфатазы клеточного цикла, и различных белков клеточной полярности, которые в совокупности обеспечивают упорядоченный переход от митоза к фазе G1 клеточного цикла. [20] Cdc14 играет ключевую роль в митотическом выходе, дефосфорилируя ключевые мишени, такие как Cdh1/Hct1 и Sic1. [20] Это действие приводит к снижению активности митотической циклин-зависимой киназы (Cdk-Clb), что является предпосылкой для митотического выхода. Регуляция Cdc14 строго контролируется; он секвестрируется в ядрышке во время интерфазы и метафазы и высвобождается в начале анафазы. Это высвобождение имеет решающее значение для Cdc14, чтобы выполнить свою функцию по запуску митотического выхода. [20] Высвобождение Cdc14 из ядрышка включает два основных этапа: первоначальное частичное высвобождение, облегчаемое сепаразой (Esp1) и полокиназой (Cdc5), и последующее полное высвобождение, регулируемое сетью митотического выхода (MEN). [20] MEN представляет собой управляемую ГТФазой сигнальную сеть, имеющую решающее значение для митотического выхода, и ее правильное функционирование необходимо для точности клеточного цикла. [20] Ключевым игроком в MEN является Tem1, небольшая Ras-подобная ГТФаза. Регулирование Tem1 является сложным и включает его инактивацию комплексом Bfa1-Bub2 GAP и активацию GEF Lte1. [20] Пространственная динамика этих взаимодействий имеет решающее значение; в то время как Tem1 связан с телом полюса веретена (SPB), Lte1 связан с корой почки, но не с материнской клеткой. Такое расположение гарантирует, что активация MEN и, следовательно, митотический выход происходят только тогда, когда ядро правильно расположено внутри почки. Белки Cdc24, Cdc42 и Ste20, посредством их взаимодействия с Lte1 и другими компонентами MEN, играют жизненно важную роль в обеспечении того, чтобы митотический выход был строго регулируемым и происходил только при соответствующих условиях (рисунок 6). [20] Например, белок клеточной полярности Cdc42 регулирует активность Ste20, подчеркивая взаимосвязанность этих путей. [20]
{{cite journal}}
: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}
: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}
: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )