Галактозооксидаза ( D-галактоза: кислород 6-оксидоредуктаза , D-галактозооксидаза , бета-галактозооксидаза ; сокращенно GAO , GAOX , GOase ; EC 1.1.3.9) — фермент , катализирующий окисление D -галактозы в некоторых видах грибов . [1] [2]
Галактозооксидаза принадлежит к семейству оксидоредуктаз . Ион меди требуется в качестве кофактора для галактозооксидазы. Примечательной особенностью галактозооксидазы является то, что она является свободнорадикальным ферментом. [3] [4] Ее каталитический участок содержит свободнорадикальный лиганд , координирующийся с медным центром. [4] Этот свободнорадикальный лиганд представляет собой ковалентно сшитые боковые цепи цистеина и тирозина , которые образуются во время посттрансляционной модификации . [3] [4]
Галактозооксидаза, обнаруженная в нескольких видах грибов, таких как Fusarium graminearum NRRL 2903 (ранее ошибочно идентифицированный как Dactylium dendroides ), [5] и других видах родов Fusarium и Aspergillus , [1] была впервые выделена в 1959 году. [6] Этот фермент секретируется грибами для функционирования во внеклеточном пространстве. [1] [3] [7] Хотя реакция окисления D-галактозы дала галактозооксидазе ее название, считается, что сопряженное восстановление дикислорода до перекиси водорода имеет большее физиологическое значение для дрожжей. [3] [4] Перекись водорода, которая может вырабатываться дрожжами таким образом, возможно, является бактериостатическим агентом . [3]
Галактозооксидаза содержит 639 аминокислот . [1] Это один пептидный мономер , который имеет три β-структурных домена . [1] [7] Домен 1 (остатки 1-155) представляет собой β-сэндвич , состоящий из восьми антипараллельных β-нитей . [3] Он содержит возможный сайт связывания для Na + или Ca 2+ , которые могут выполнять структурные роли в белке. [3] Еще одной особенностью Домена 1 является наличие сайта связывания углеводов, который направляет фермент на связывание с внеклеточными углеводами. [3] Домен 2 (остатки 156-552) содержит сайт связывания меди. [1] β-нитеи в Домене 2 организованы как семикратный пропеллер, [1] и каждая из семи структурных единиц представляет собой субдомен, состоящий из четырех антипараллельных β-нитей. [3] Домен 3 (остатки 553-639) состоит из семи антипараллельных β-нитей и образует «колпачок» над Доменом 2. Один гистидин (His581) Домена 3 служит лигандом для меди, способствуя образованию металлсодержащего активного центра фермента. [1]
Галактозооксидаза — это медный белок типа II . [1] [8] Он содержит один медный центр, который принимает квадратную плоскую или квадратную пирамидальную геометрию координации . [3] [4] [9] Медный центр имеет пять координирующих лигандов: два тирозина (Tyr272 и Tyr495), два гистидина (His496 и His581) и молекулу растворителя, которая обычно является водой. [3] [4] Медь в активном центре галактозооксидазы описывается как имеющая «искаженную квадратную пирамидальную» геометрию координации. [3] [4] Tyr495 является аксиальным лигандом, остальные четыре лиганда лежат примерно в одной плоскости. Оба гистидина координируются с медью через 3-азот . [3] Связь медь-H 2 O является самой длинной координационной связью ; [3] [4] она лабильна и может быть заменена молекулой субстрата. Tyr272 образует димер с цистеином (Cys228) через орто-углерод тирозина и атом серы цистеина, что подтверждается исследованиями рентгеновской кристаллографии . [1] [3] [4] [10] Сшивка Tyr-Cys снижает структурную гибкость Tyr272. [3] Этот сшитый тирозинат также является свободным радикалом. В полностью окисленной форме галактозооксидазы свободный радикал связывается с центром меди (II) антиферромагнитно , что подтверждается исследованиями ЭПР-спектроскопии . [4] [6] Более того, образование сшивающей тиоэфирной связи , как полагают, снижает окислительный потенциал феноксида Tyr272 , делая этот феноксил более легко окисляемым с образованием радикала в посттрансляционной модификации. [1] [3] [8]
Свободный радикал в галактозооксидазе необычайно стабилен по сравнению со многими другими свободными радикалами белков. [2] [3] Лиганд свободного радикала стабилизируется в основном двумя способами. Во-первых, как показали исследования вычислительной химии , неспаренный электрон стабилизируется посредством делокализации ароматическим кольцом тирозина и сшитой серой цистеина, при этом атом кислорода Tyr272 обладает высокой плотностью неспаренных электронов . [1] [4] [9] Некоторые экспериментальные данные также свидетельствуют о том, что аксиальный Tyr495 также участвует в делокализации неспаренных электронов. [3] Во-вторых, индольное кольцо триптофана ( Trp290) лежит выше и параллельно тирозин-цистеину, ведя себя как щит, защищающий радикал от внешней среды растворителя. [1] [3] [4] Подтверждающие данные получены из того, что мутация этого остатка триптофана приводит к более низкой стабильности активной формы галактозооксидазы. [3] Кроме того, внешняя сфера активного центра состоит из множества ароматических остатков, которые придают активному центру гидрофобный характер. [3] Также активный центр окружен обширными сетями водородных связей . [3]
У дрожжей галактозооксидаза катализирует следующую реакцию: [1] [4]
Эта реакция по сути является окислением первичного спирта с использованием дикислорода для образования соответствующего альдегида и перекиси водорода . [1] [4] Было показано, что галактозооксидаза также способна катализировать различные первичные спирты, отличные от галактозы. [2] [3] Фактически, галактозооксидаза катализирует дигидроксиацетон в три раза быстрее, чем галактозу. [3] Реакция является региоселективной , то есть она не может окислять вторичный спирт. [3]
Это двухэлектронное окисление достигается двойным окислительно-восстановительным центром: металлическим центром меди (II) и свободным радикалом, каждый из которых способен принимать один электрон от субстрата. [4] Этот двойной окислительно-восстановительный центр имеет три доступных уровня окисления. [4] В каталитическом цикле галактозооксидазы фермент перемещается между полностью окисленной формой и полностью восстановленной формой. [4] Полуокисленная форма является неактивной формой.
Принятый каталитический механизм, называемый «механизмом пинг-понга», состоит из четырех основных стадий. [1] [4] [9] [11] Первая стадия — окисление субстрата двойным окислительно-восстановительным центром. После того, как гидроксильная группа спирта субстрата занимает место координации растворителя, гидроксильная группа депротонируется Tyr495, после чего следует высвобождение Tyr495. [12] [1] Этот этап делает спирт более склонным к окислению. [4] Протон на углероде, к которому раньше была присоединена гидроксильная группа, затем переносится на Tyr272 (служащий акцептором водорода), сопряженный с окислением субстрата. Один электрон переходит к радикальному лиганду, другой электрон переходит к центру меди (II), который затем в результате восстанавливается до меди (I). Тем временем радикал Tyr272 также восстанавливается. [4] Этап вычитания протона является определяющим скорость и стереоспецифичным , поскольку удаляется только водород pro-S на углероде спирта (подтверждено исследованиями его кинетического изотопного эффекта). [1] [3] [4] Общим результатом этапа 1 является удаление двух атомов водорода и удаление двух электронов из субстрата, порядок которых, однако, неясен. [1] [4] Второй этап - высвобождение окисленного субстрата (альдегида в данном случае) и координация дикислорода в месте координации субстрата. На третьем этапе дикислород быстро восстанавливается медью(I) с образованием супероксида . Супероксид является реакционноспособным видом, который вычитает протон и электрон из Tyr272 и повторно формирует радикал тирозина. На четвертом этапе гидропероксид депротонирует Tyr496 и высвобождается в виде H 2 O 2 . Последующая аксиальная координация Tyr496 и экваториальная координация новой молекулы субстрата с медным центром завершают оборот фермента.
Prepro -GAOX (галактозооксидаза с сигнальной последовательностью) дважды обрабатывается протеолитическим расщеплением в лидерной последовательности для образования зрелого пептида GAOX (pro-GAOX). [3] Первое расщепление удаляет последовательность из 24 аминокислот сигнальной пептидазой . [3] Второе расщепление удаляет еще одну последовательность из 17 аминокислот. [3]
Ковалентная связь между Tyr272 и Cys228 образуется после того, как был сделан pro -GAOX. [4] Для возникновения этой модификации, по-видимому, не требуются какие-либо другие «вспомогательные» белки. [3] [10] Текущий механизм образования этой ковалентной связи предполагает необходимость меди(I) и дикислорода. [3] [4] Механизм этой связи тирозин-цистеин до конца не изучен, но было предсказано несколько ключевых событий: [1] медь(I) координируется с Tyr272 и гистидинами в (будущем) активном центре. Реакция дикислорода с комплексом активного центра генерирует свободнорадикальный промежуточный продукт . Возможны две формы свободного радикала, тиил и феноксил ; [3] добавление тиилового радикала к фенолу или добавление феноксильного радикала к тиолу генерирует ковалентную связь между атомом серы цистеина и ароматическим кольцом тирозина; [2] Вторая молекула дикислорода реагирует с медным центром, координированным сшитым тирозин-цистеином, образуя комплекс радикал-медь. [3] [4]
Биомолекулы в образцах, таких как галактоза, можно количественно определить с помощью метода обнаружения кислорода, поскольку одно эквивалентное потребление кислорода соответствует одному эквиваленту окисленной первичной гидроксильной группы. [3] Образование перекиси водорода во время окисления субстрата также можно использовать для колориметрического обнаружения галактозы с использованием красителей, которые окисляются перекисью водорода. [3] Поскольку углеводы обычно могут иметь первичные гидроксильные группы, галактозооксидазу можно использовать для модификации гликопротеинов клеточной поверхности с целью маркировки клеток. [3]
Галактозооксидаза использовалась в качестве биокатализатора в синтезе альдегидов и карбоновых кислот из первичных спиртов. [3]
Наше понимание механизма галактозооксидазы вдохновляет исследователей на разработку модельных соединений, которые имитируют структуру и функцию галактозооксидазы. [4] Похоже, что электронное разделение между медью и свободным радикалом является решающим элементом в успешном синтезе этих соединений. [4] Первое модельное соединение GAOX — это [Cu(II)(dnc)], которое использует дункамин ( dnc ) в качестве хелатирующего лиганда . [3] Другие модельные соединения были изучены и описаны в литературе. [6] [8] [9] [13] [14]
